Met behulp van synthetische biologie levende cellen Engineer die interface met programmeerbare Materials
Summary
Dit artikel presenteert een reeks protocollen voor het ontwikkelen van gemanipuleerde cellen en gefunctionaliseerde oppervlakken die het mogelijk maken synthetisch gemanipuleerde E. coli te beheersen en te manipuleren programmeerbare materiaal oppervlakken.
Abstract
We hebben een abiotische-biotische interface waarmee gemodificeerde cellen aan de materiaaleigenschappen van een gefunctionaliseerd oppervlaktebesturingseenheid ontwikkeld. Dit systeem bestaat, door twee modules: een synthetisch gemodificeerde stam van E. coli cellen en een gefunctionaliseerd materiaal interface. In dit document, we detail een protocol voor genetisch manipuleren geselecteerde gedrag in een stam van E. coli met behulp van moleculaire klonering strategieën. Eenmaal ontwikkeld, dit soort produceert hoge gehalten aan biotine bij blootstelling aan een chemische inductor. Daarnaast hebben we detail protocollen voor het maken van twee verschillende gefunctionaliseerde oppervlakken, waarvan elk kan inspelen op cel gesynthetiseerd biotine. Samengevat presenteren we een methode voor het maken van een gekoppelde, abiotische-biotische systeem waarmee gemanipuleerde cellen materiaalsamenstelling en montage controleren op niet-levende substraten.
Introduction
Hier melden wij procedures voor de ontwikkeling van een programmeerbare substraat kan reageren op een chemisch signaal van een gemodificeerde cellijn. 1 Wij doen dit door het creëren van een biotine-streptavidine-interface die reageert op biotine geproduceerd door synthetisch gemanipuleerde Escherichia coli (E. coli) cellen. Eerder hebben programmeerbare oppervlakken is ontworpen voor een breed scala aan toepassingen van toxine detectie 2 en point-of-care diagnostiek 3 defensie en veiligheid. 4 Terwijl programmeerbare oppervlakken bruikbaar als sensoren en actuatoren kunnen zijn, kunnen ze "slimmer" worden gemaakt door ze te begiftigen met het vermogen tot aanpassing aan verschillende milieuproblemen. Daarentegen, zelfs eenvoudige micro-organismen, zoals E. coli, inherente flexibiliteit en kunnen reageren op uitdagingen geavanceerde en vaak onverwachte oplossingen. Dit aanpassingsvermogen heeft ingeschakeld E.coli bevolking, bestuurd door hun complexe gen-netwerken, op een kosteneffectieve manier te zoeken middelen, 5 creëren producten met toegevoegde waarde, 6 en zelfs de macht micro-schaal robotica. 7 Door het koppelen van de adaptieve voordelen van levende cellen met behulp van programmeerbare oppervlakken, kunnen we een slimme substraat kan reageren op verschillende omgevingsomstandigheden maken.
Synthetische biologie onderzoekers nieuwe mogelijkheden gegeven om het gedrag van levende organismen programmeren. Door engineering van cellen om nieuw gen regulerende netwerken bevatten, kunnen onderzoekers cellen die een reeks van geprogrammeerde gedrag vertonen ontwerpen. 8, 9 voorbij basisonderzoek, kan dit gedrag worden gebruikt voor toepassingen zoals regelend materiaal montage en biologisch produceren van producten met toegevoegde waarde. 10 Hierin we detail hoe we gebruik gemaakt van de instrumenten van de synthetische biologie tot engineer een E. coli-stam die biotine synthetiseert na inductie. Deze stam werd ontwikkeld door gebruikmaking van restrictie-enzym kloneringswerkwijzen een plasmide, pKE1-lad-bioB monteren. Dit plasmide, wanneer getransformeerd in E. coli stam K-12 MG1655, begiftigt cellen met het vermogen om verhoogde niveaus van bioB, een enzym voor biotine synthese drukken. Wanneer getransformeerde cellen werden geïnduceerd met isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en voorzien van een biotine precursor, desthiobiotine (DTB), werden verhoogde niveaus van biotine geproduceerd.
De bindingsinteractie biotine met streptavidine is een van de sterkste niet-covalente bindingen in de natuur. Als zodanig, de biotine-streptavidine interactie zowel goed gekarakteriseerd en zeer gebruikt in biotechnologie. 11 Binnen dit manuscript, presenteren we twee strategieën in dienst van de biotine-streptavidine interactie aan te voelen en op te sporen cel geproduceerd biotine met een gefunctionaliseerd oppervlak. Wijverwijzen naar deze contrasterende oppervlakken als "indirecte" en "direct" control regelingen. In de besturing indirecte cel geproduceerd biotine concurreert met biotine dat is geconjugeerd en geïmmobiliseerd op een polystyreen oppervlak voor streptavidine bindingsplaatsen. Bovendien wordt de streptavidine geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP). HRP wijzigt 3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB), een optisch signaal, 12 dat kan worden gevolgd door kwantificeren van de spectrale absorptie (dwz optische dichtheid) bij 450 nm (OD 450) te produceren. Zo is de besturing indirect stelt onderzoekers in staat om cellen geproduceerd biotine te meten door het bewaken van de attentuation van de OD 450 signaal.
De directe besturing maakt gebruik van de streptavidine-biotine event door immobiliseren streptavidine rechtstreeks op een materiaaloppervlak en waardoor cellen geproduceerd biotine en gebiotinyleerde HRP om te concurreren voor streptavidine bindingsplaatsen. Nogmaals, derelatieve niveaus van cel geproduceerde biotine worden gevolgd door het meten van een OD 450 signaal.
Samengevat, de gemanipuleerde cellen en gefunctionaliseerde oppervlakken kunnen we de eigenschappen van een programmeerbare oppervlaktebesturingseenheid door het induceren netwerken in levende cellen. Met andere woorden, hebben we een systeem dat gebruik maakt van het aanpassingsvermogen van levende organismen en de betrouwbaarheid en de specificatie van een aangelegde materiaal-interface door het koppelen van deze systemen gemaakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een nieuwe strategie voor het koppelen van gemodificeerde levende cellen met een gefunctionaliseerd materiaaloppervlak gepresenteerd. Dit werd bereikt door de ontwikkeling van een cellijn die in staat synthetiseren verhoogde biotine wanneer geïnduceerd met IPTG. De verhoogde niveaus van biotine kan dan worden gebruikt om het gefunctionaliseerde oppervlak wijzigen. De protocollen gedetailleerd hoe de E. coli cellijn ingenieur en hoe u twee verschillende gefunctionaliseerde oppervlakken te creëren. </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs dankbaar steun van award FA9550-13-1-0108 uit de Air Force Office van Wetenschappelijk Onderzoek van de Verenigde Staten te erkennen. De auteurs bovendien steun van award N00014-15-1-2502 erkennen van het Office of Naval Research van de Verenigde Staten, de financiering van het Instituut voor Technologie en kritische Applied Science aan de Virginia Polytechnic Institute and State University, en van de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, award nummer 1.607.310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
References
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -. H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
- Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
- Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
- Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
- Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
- Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988 (2015).
- Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401 (2014).
- Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
- Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
- Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
- Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
- Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob, A. J., Lee, Y. J., Sever, J., L, Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
