Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien
Summary
Dieser Beitrag stellt eine Reihe von Protokollen für die gentechnisch veränderten Zellen entwickeln und funktionalisierte Oberflächen , die synthetisch konstruierte E. coli steuern können , und programmierbare Materialoberflächen zu manipulieren.
Abstract
Wir haben einen abiotischen-biotischen Schnittstelle entwickelt, die gentechnisch veränderten Zellen erlaubt es, die Materialeigenschaften eines funktionalisierten Oberfläche zu steuern. Eine synthetisch konstruierte Stamm von E. coli Zellen und eine funktionalisierte Materialoberfläche: Dieses System wird durch die Schaffung von zwei Modulen. Innerhalb dieses Papier wir detailliert ein Protokoll für die gentechnische Veränderung von ausgewählten Verhalten in einem Stamm von E. coli unter Verwendung von molekularem Klonierungsstrategien. Einmal entwickelt, produziert dieser Stamm erhöhte Mengen an Biotin, wenn sie einer chemischen Induktors ausgesetzt. Zusätzlich wir detaillierter Protokolle zur Schaffung von zwei unterschiedlichen funktionalisierten Oberflächen, von denen jede Lage zu Zelle synthetisierte Biotin zu reagieren. Zusammengenommen stellen wir eine Methodik ein verknüpftes, abiotische-biotische System für die Erstellung, die Zellen zu steuern, Materialzusammensetzung und die Montage auf nicht lebenden Substraten entwickelt, ermöglicht.
Introduction
Hier berichten wir über die Verfahren für eine programmierbare Substrat zu entwickeln, das von einer konstruierten Zelllinie ein chemisches Signal reagiert. 1 Wir tun dies durch eine Biotin-Streptavidin – Schnittstelle zu schaffen, die von synthetisch engineered Escherichia coli (E. coli) Zellen erzeugt an Biotin reagiert. Zuvor programmierbare Oberflächen wurden für eine Vielzahl von Anwendungen von Toxinnachweis 2 und Point-of-Care – Diagnostik 3 Verteidigung und Sicherheit entwickelt. 4 Während programmierbare Oberflächen können nützlich als Sensoren und Aktoren sein, können sie gemacht "intelligenter" werden , indem sie mit der Fähigkeit zur Anpassung an verschiedene Umweltprobleme ausstatten. Im Gegensatz dazu sogar einfache Mikroorganismen, wie E. coli, weisen inhärente Anpassungsfähigkeit und sind in der Lage Challenges mit ausgeklügelter und oft unerwartete Lösungen reagieren. Diese Anpassungsfähigkeit ermöglicht hat E.coli – Populationen durch ihre komplexe Gen – Netzwerke gesteuert, kosteneffektiv Ressourcen suchen, 5 Mehrwert-Produkte erstellen, 6 und sogar Strommikromaßstab Robotik. 7 Durch die Kopplung der adaptive Vorteile von Zellen mit der Verwendung von programmierbaren Oberflächen leben, können wir ein Smart Substrat fähig der Reaktion auf unterschiedliche Umweltbedingungen zu schaffen.
Synthetische Biologie hat sich die Forscher neue Fähigkeiten gegeben, das Verhalten von Lebewesen zu programmieren. Durch Zellen Engineering neue Gen regulatorische Netzwerke enthalten, können die Forscher Zellen entwickeln, die eine Reihe von programmierten Verhalten zeigen. 8, 9 Jenseits der Grundlagenforschung, diese Verhaltensweisen für Anwendungen wie Material Montage Steuern und biologisch produzierenden Mehrwert-Produkte werden können. 10 Hierin wir ausführlich , wie wir die Werkzeuge der synthetischen Biologie verwendet , um eningenieur ein E. coli – Stamm, der Biotin bei Induktion synthetisiert. Dieser Stamm wurde unter Verwendung von Restriktionsenzym-Klonierungsverfahren entwickelt ein Plasmid, pKE1-lacI-bioB zu montieren. Dieses Plasmid, wenn es in E. coli – Stamm K-12 MG1655 transformiert, ausstattet Zellen mit der Fähigkeit , erhöhte Mengen an bioB, ein essentielles Enzym für die Biotin – Synthese zu exprimieren. Wenn transformierte Zellen mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und mit einem Biotin-Vorläufer Desthiobiotin (DTB) induziert wurden, wurden erhöhte Spiegel an Biotin hergestellt.
Biotin der Bindungs-Wechselwirkung mit Streptavidin ist einer der stärksten nicht-kovalenten Bindungen in der Natur gefunden. Als solches ist das Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung sowohl gut charakterisiertes und hoch in der Biotechnologie eingesetzt. 11 In diesem Manuskript, stellen wir zwei Strategien , um die Biotin-Streptavidin – Wechselwirkung unter Verwendung von zell hergestellt Biotin mit einer funktionalisierten Oberfläche zu erfassen und zu erkennen. Wirbeziehen sich auf diese kontrastierenden Oberflächen als "indirekte" und "direkt" Steuerungsschemata. Bei der indirekten Steuerschema, Zelle produzierte Biotin konkurriert mit Biotin, die für Streptavidin-Bindungsstellen auf einer Polystyroloberfläche konjugiert und immobilisiert wurde. Zusätzlich wird das Streptavidin mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert. HRP modifiziert 3, 3 ', 5, 5'-Tetramethylbenzidin (TMB), ein optisches Signal 12 zu erzeugen , die durch Quantifizierung der spektralen Extinktion (dh, optische Dichte) bei 450 nm (OD 450) überwacht werden kann. Somit erlaubt die indirekte Steuerschema Forscher durch die Überwachung der Abschwächung des OD 450 Signalzelle produzierten Biotin zu messen.
Die direkte Steuerungsschema nutzt die Streptavidin-Biotin-Ereignis durch Streptavidin direkt auf eine Materialoberfläche zu immobilisieren und ermöglicht Zelle produzierten Biotin und biotinylierte HRP für Streptavidin-Bindungsstellen zu konkurrieren. Wiederum ist dasrelativen Mengen an zell erzeugt Biotin sind durch Messen einer OD 450 – Signal überwacht.
Zusammengenommen sind die gentechnisch veränderten Zellen und funktionalisierten Oberflächen erlauben, die Eigenschaften eines programmierbaren Oberfläche zu steuern, indem Netzwerke in lebenden Zellen zu induzieren. Mit anderen Worten, haben wir ein System geschaffen, das gemeinsam durch die Verknüpfung dieser Systeme Vorteil der Anpassungsfähigkeit von lebenden Organismen und die Zuverlässigkeit und die Spezifikation einer engineered Materialgrenzfläche stattfindet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben für die Anbindung entwickelt lebenden Zellen mit einem funktionalisierten Materialoberfläche eine neue Strategie vorgestellt. Dies wurde durch die Entwicklung einer Zelllinie erreicht der Lage, erhöhte Konzentrationen von Biotin zu synthetisieren, wenn sie mit IPTG induziert. Die erhöhten Mengen an Biotin kann dann verwendet werden, um die funktionalisierte Oberfläche zu modifizieren. Die Protokolle detailliert , wie die E. coli – Zelllinie zu entwickeln und , wie zwei verschiedene funktionalisie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Unterstützung von preis FA9550-13-1-0108 von der Air Force Office of Scientific Research der USA. Die Autoren erkennen zusätzlich Unterstützung von preis N00014-15-1-2502 vom Office of Naval Research der USA, aus dem Institut die Finanzierung für kritische Technik und angewandte Wissenschaft an der Virginia Polytechnic Institute und State University und der National Science Foundation Graduierten Fellowship-Programm, Verleihungsnummer 1607310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
References
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