जीवित कोशिकाओं अभियंता को सिंथेटिक जीव विज्ञान का प्रयोग कि प्रोग्राम सामग्री के साथ इंटरफेस
Summary
इस पत्र इंजीनियर कोशिकाओं और क्रियाशील सतहों कि कृत्रिम नियंत्रित करने और हेरफेर प्रोग्राम सामग्री सतहों के लिए ई कोलाई इंजीनियर सक्षम विकसित करने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत करता है।
Abstract
हम एक अजैव-बायोटिक इंटरफेस है कि इंजीनियर कोशिकाओं को एक क्रियाशील सतह की सामग्री के गुणों को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है विकसित किया है। ई कोलाई कोशिकाओं का एक कृत्रिम इंजीनियर तनाव और एक क्रियाशील सामग्री इंटरफ़ेस: इस प्रणाली के दो मॉड्यूल बनाने के द्वारा किया जाता है। इस पत्र के भीतर, हम विस्तार आनुवंशिक रूप से आणविक क्लोनिंग रणनीतियों का उपयोग ई कोलाई के एक तनाव के भीतर चयनित व्यवहार इंजीनियरिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है। एक बार विकसित की है, इस तनाव जब एक रासायनिक inducer के संपर्क में बायोटिन का ऊंचा स्तर पैदा करता है। इसके अतिरिक्त, हम विस्तार दो अलग क्रियाशील सतहों, जिनमें से प्रत्येक कोशिका में संश्लेषित बायोटिन के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम है बनाने के लिए प्रोटोकॉल। साथ में ले ली, हम एक लिंक, अजैव-बायोटिक सिस्टम इंजीनियर निर्जीव substrates पर सामग्री संरचना और विधानसभा को नियंत्रित करने की अनुमति देता है कि कोशिकाओं को बनाने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं।
Introduction
यहाँ, हम एक प्रोग्राम एक इंजीनियर सेल लाइन से एक रासायनिक संकेत का जवाब देने में सक्षम सब्सट्रेट के विकास के लिए प्रक्रियाओं की रिपोर्ट। 1 हम एक बायोटिन streptavidin इंटरफेस कृत्रिम इंजीनियर कोलाई (ई कोलाई) कोशिकाओं द्वारा उत्पादित बायोटिन के लिए जवाब है कि बनाने के द्वारा यह करते हैं। इससे पहले, प्रोग्राम सतहों विष का पता लगाने 2 और बिंदु का ख्याल निदान 3 रक्षा और सुरक्षा से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इंजीनियर किया गया है। प्रोग्राम सतहों सेंसरों और actuators के रूप में उपयोगी हो सकता है 4, वे उन्हें विभिन्न पर्यावरणीय चुनौतियों के लिए अनुकूल करने की क्षमता के साथ endowing द्वारा "होशियार" बनाया जा सकता है। इसके विपरीत, इस तरह के ई कोलाई के रूप में भी सरल सूक्ष्मजीवों, निहित अनुकूलनशीलता है और परिष्कृत और अक्सर अप्रत्याशित समाधान के साथ चुनौतियों का जवाब देने में सक्षम हैं। इस अनुकूलनशीलता ई सक्षम हैकोलाई आबादी, उनके जटिल जीन नेटवर्क द्वारा नियंत्रित है, लागत प्रभावी ढंग से करने के लिए संसाधनों की तलाश है, 5 बनाने मूल्य वर्धित उत्पादों, 6 और यहां तक कि बिजली सूक्ष्म पैमाने रोबोटिक्स। 7 प्रोग्राम सतहों के उपयोग के साथ जीवित कोशिकाओं के अनुकूली फायदे के युग्मन, हम एक स्मार्ट सब्सट्रेट विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों का जवाब देने में सक्षम बना सकते हैं।
सिंथेटिक जीव विज्ञान शोधकर्ताओं ने नई क्षमताओं दिया है रहने वाले जीवों के व्यवहार के कार्यक्रम के लिए। कोशिकाओं इंजीनियरिंग नई जीन विनियामक नेटवर्क को रोकने के लिए, शोधकर्ताओं कोशिकाओं है कि क्रमादेशित व्यवहार की एक श्रृंखला की प्रदर्शनी डिजाइन कर सकते हैं। 8, 9 बुनियादी अनुसंधान के अलावा, इन कार्यों ऐसी सामग्री विधानसभा को नियंत्रित करने और मूल्य वर्धित उत्पादों जैविक रूप से उत्पादन के रूप में आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 10 के साथ साथ, हम विस्तार कैसे हम करने के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान के उपकरणों का इस्तेमाल enएक ई कोलाई तनाव है कि प्रेरण पर बायोटिन synthesizes gineer। इस तनाव एक प्लाज्मिड, pKE1-Laci-bioB इकट्ठा करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम क्लोनिंग तरीकों का उपयोग करके विकसित किया गया था। यह प्लाज्मिड, जब ई कोलाई तनाव K-12 MG1655 में तब्दील, bioB, बायोटिन संश्लेषण के लिए एक आवश्यक एंजाइम का ऊंचा स्तर व्यक्त करने की क्षमता के साथ कोशिकाओं endows। बदल कोशिकाओं isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के साथ प्रेरित और एक बायोटिन अग्रदूत, desthiobiotin (DTB) के साथ प्रदान किया गया है, बायोटिन का ऊंचा स्तर का उत्पादन किया गया।
बायोटिन की streptavidin के साथ बाध्यकारी बातचीत मजबूत न सहसंयोजक प्रकृति में पाया बांड में से एक है। जैसे, बायोटिन streptavidin बातचीत दोनों अच्छी तरह से विशेषता और अत्यधिक जैव प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में कार्यरत है। 11 इस पांडुलिपि के भीतर, हम दो रणनीतियों बायोटिन streptavidin बातचीत भावना और एक क्रियाशील सतह के साथ सेल का उत्पादन बायोटिन पता लगाने के लिए रोजगार प्रस्तुत करते हैं। हमके रूप में "अप्रत्यक्ष" और "प्रत्यक्ष" नियंत्रण योजनाओं इन विषम सतहों को देखें। अप्रत्यक्ष नियंत्रण योजना में सेल का उत्पादन बायोटिन बायोटिन कि संयुग्मित किया गया है और बाध्यकारी साइटों streptavidin के लिए एक polystyrene सतह पर स्थिर साथ प्रतिस्पर्धा। इसके अलावा, streptavidin हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के साथ संयुग्मित है। एचआरपी 3, 3, 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB), एक ऑप्टिकल संकेत, 12 जो 450 एनएम (आयुध डिपो 450) पर वर्णक्रम absorbance (यानी, ऑप्टिकल घनत्व) बढ़ाता द्वारा नजर रखी जा सकती उत्पादन करने के लिए संशोधित करता है। इस प्रकार, अप्रत्यक्ष नियंत्रण योजना के शोधकर्ताओं ने आयुध डिपो के 450 संकेत के attentuation की निगरानी के द्वारा सेल का उत्पादन बायोटिन को मापने के लिए अनुमति देता है।
प्रत्यक्ष नियंत्रण योजना एक सामग्री की सतह को सीधे streptavidin immobilizing और बाध्यकारी साइटों streptavidin के लिए प्रतिस्पर्धा करने के लिए सेल का उत्पादन बायोटिन और biotinylated एचआरपी अनुमति देकर streptavidin बायोटिन घटना कारनामे। फिर,सेल का उत्पादन बायोटिन के रिश्तेदार का स्तर एक आयुध डिपो के 450 संकेत को मापने के द्वारा निगरानी कर रहे हैं।
साथ में ले ली, इंजीनियर कोशिकाओं और क्रियाशील सतहों हमें जीवित कोशिकाओं में नेटवर्क उत्प्रेरण द्वारा एक प्रोग्राम सतह के गुणों को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देते हैं। दूसरे शब्दों में, हम एक प्रणाली है कि इन प्रणालियों को एक साथ जोड़ने के द्वारा रहने वाले जीवों की अनुकूलन क्षमता और विश्वसनीयता और एक इंजीनियर सामग्री इंटरफेस के विनिर्देश का फायदा उठाते हैं बनाया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक क्रियाशील सामग्री की सतह के साथ रहने वाले इंजीनियर कोशिकाओं interfacing के लिए एक नई रणनीति प्रस्तुत किया है। यह एक सेल लाइन बायोटिन का ऊंचा स्तर synthesizing जब IPTG साथ प्रेरित करने में सक्षम विकसित करके पूरा कि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों कृतज्ञता संयुक्त राज्य अमेरिका के वैज्ञानिक अनुसंधान की वायु सेना के कार्यालय से पुरस्कार FA9550-13-1-0108 से समर्थन स्वीकार करते हैं। लेखकों इसके अतिरिक्त संयुक्त राज्य अमेरिका के नौसेना अनुसंधान के कार्यालय से पुरस्कार N00014-15-1-2502 से समर्थन स्वीकार करते हैं, वर्जीनिया पॉलिटेक्निक संस्थान और राज्य विश्वविद्यालय, पर क्रिटिकल प्रौद्योगिकी और एप्लाइड साइंस के लिए संस्थान से और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च से धन फैलोशिप कार्यक्रम, पुरस्कार नंबर 1607310।
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
References
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -. H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
- Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
- Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
- Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
- Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
- Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988 (2015).
- Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401 (2014).
- Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
- Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
- Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
- Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
- Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob, A. J., Lee, Y. J., Sever, J., L, Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
