Använda Syntetisk biologi ingenjör levande celler som har gränssnitt programmerbara material
Summary
Detta dokument presenterar en serie av protokoll för att utveckla manipulerade celler och funktionaliserade ytor som möjliggör syntetiskt engineered E. coli för att styra och manipulera programmerbara materialytor.
Abstract
Vi har utvecklat en abiotisk-biotisk gränssnitt som gör att gentekniskt modifierade celler för att styra materialegenskaper hos en funktionaliserad yta. Detta system görs genom att skapa två moduler: en syntetiskt konstruerad stam av E. coli-celler och ett funktionaliserat material gränssnitt. Inom detta papper, vi detalj ett protokoll för genetisk manipulering utvalda beteenden inom en stam av E. coli med användning av molekylära kloningsstrategier. När de har utvecklats, producerar denna stam förhöjda nivåer av biotin när den utsätts för en kemisk inducerare. Dessutom, vi detalj protokoll för att skapa två olika funktionaliserade ytor, vilka var och en är i stånd att svara på cell syntetiserade biotin. Sammantaget presenterar vi en metod för att skapa en länkad, abiotisk-biotiska system som tillåter engineered celler för att styra materialsammansättning och montering på icke-levande substrat.
Introduction
Här rapporterar vi förfarandena för att utveckla en programmerbar substrat kan svara på en kemisk signal från en konstruerad cellinje. 1 Vi gör detta genom att skapa ett biotin-streptavidin gränssnitt som reagerar på biotin produceras av syntetiskt konstruerad Escherichia coli (E. coli) celler. Tidigare har programmerbara ytor är konstruerad för ett brett spektrum av applikationer från toxin upptäckt två och point-of-care diagnos 3 till försvar och säkerhet. 4 Medan programmerbara ytor kan vara användbara som sensorer och ställdon, kan de göras "smartare" genom att förse dem med förmågan att anpassa sig till olika miljöutmaningar. I motsats, även enkla mikroorganismer, såsom E. coli, har inneboende anpassningsförmåga och är i stånd att svara på utmaningarna med sofistikerade och ofta oväntade lösningar. Denna anpassningsförmåga har gjort det möjligt E.coli populationer, som styrs av deras komplexa gennätverk, att kostnadseffektivt söka resurser, 5 skapar förädlade produkter, 6 och strömmikroskala robotik. 7 Genom att koppla de adaptiva fördelarna med levande celler med användning av programmerbara ytor, kan vi skapa en smart substrat som kan svara mot olika miljöförhållanden.
Syntetisk biologi har gett forskarna nya förmågor att programmera beteendet hos levande organismer. Genom att konstruera celler att innehålla nya regulatoriskt gennätverk kan forskare utforma celler som uppvisar en rad programmerade beteenden. 8, 9 Utöver grundforskning, kan dessa beteenden användas för applikationer såsom styrning av material montering och biologiskt producera förädlade produkter. 10 Häri vi detalj hur vi använt verktyg för syntetisk biologi till eningenjören en E. coli-stam som syntetiserar biotin vid induktion. Denna stam har utvecklats med hjälp av restriktionsenzymkloningsmetoder för att montera en plasmid, pKE1-lacl-bioB. Denna plasmid, när transformerades in i E. coli stam K-12 MG1655, förser celler med förmågan att uttrycka förhöjda halter av bioB, ett essentiellt enzym för biotin syntes. När transformerade celler inducerades med isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) och försedd med en biotin-prekursor, destiobiotin (DTB), var förhöjda nivåer av biotin som produceras.
Biotin: s bindningsinteraktion med streptavidin är en av de starkaste icke-kovalenta bindningar som finns i naturen. Som sådan är biotin-streptavidin samspel både väl karaktäriserade och ytterst användas inom bioteknik. 11 Inom detta manuskript, presenterar vi två strategier som utnyttjar biotin-streptavidin samspel för att känna och upptäcka cell producerade biotin med en funktionaliserade ytan. Vihänvisa till dessa kontrasterande ytor som "indirekta" och "direkta" styrscheman. I den indirekta kontrollschema, konkurrerar cell-producerade biotin med biotin som har konjugerats och immobiliseras på en polystyren yta för streptavidin bindningsställen. Dessutom är den streptavidin konjugerat med pepparrotsperoxidas (HRP). HRP modifierar 3, 3 ', 5, 5'-tetrametylbensidin (TMB), för att producera en optisk signal, 12 som kan övervakas genom att kvantifiera den spektrala absorbansen (dvs optisk densitet) vid 450 nm (OD 450). Således, den indirekta kontrollschema tillåter forskare att mäta cellproducerade biotin genom att övervaka dämpning av OD 450 signalen.
Direkt kontroll systemet utnyttjar streptavidin-biotin händelse genom att immobilisera streptavidin direkt till en materialytan och tillåter cellproducerade biotin och biotinylerad HRP att konkurrera om streptavidin bindningsställen. Återigen, denrelativa nivåerna av cell-producerade biotin övervakas genom att mäta en OD 450-signal.
Sammantaget manipulerade celler och funktionaliserade ytor tillåter oss att styra egenskaperna hos en programmerbar yta genom att inducera nätverk i levande celler. Med andra ord har vi skapat ett system som utnyttjar anpassningsförmåga levande organismer och tillförlitlighet och specifikation av en konstruerad material gränssnitt genom att koppla dessa system tillsammans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presenterat en ny strategi för samverkan manipulerade levande celler med ett funktionaliserat material yta. Detta åstadkoms genom att utveckla en cellinje med förmåga att syntetisera förhöjda nivåer av biotin vid induktion med IPTG. De förhöjda nivåerna av biotin kan sedan användas för att modifiera den funktionaliserade ytan. De protokoll som beskrivs hur man konstruera E. coli-cell linje och hur man skapar två olika funktionaliserade ytor.
Kritiska steg i detta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt stöd från tilldelning FA9550-13-1-0108 från Air Force Office of Scientific Research i USA. Författarna dessutom erkänner stöd från tilldelning N00014-15-1-2502 från Office of Naval Research i USA, finansiering från Institutet för kritisk teknik och tillämpad vetenskap vid Virginia Polytechnic Institute och State University och från National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, utmärkelse nummer 1.607.310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
References
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -. H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
- Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
- Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
- Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
- Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
- Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988 (2015).
- Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401 (2014).
- Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
- Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
- Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
- Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
- Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob, A. J., Lee, Y. J., Sever, J., L, Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
