本议定书描述了使用水槽拭子和对斑马鱼系统的污泥分析, 这导致检测比唯一使用哨兵检测病原体, 如单胞菌水气, 分枝杆菌, 和Pseudocapillaria 毛白杨。此外, 还提出了一种在检疫中监测毛白杨卵的系统。
健康监测系统是开发和使用在斑马鱼的研究设施, 因为病原体的斑马鱼, 如单胞菌水气, 分枝杆菌, 和Pseudocapillaria 毛白杨有潜力损害动物福利和研究。鱼通常被分析为检测微生物的宰后。使用哨兵是一个建议的方式, 以提高灵敏度的监测和减少动物数量的样本。介绍了一种用于循环系统的预过滤哨兵箱的设置。该技术的发展是为了防止水污染, 并通过仔细选择年龄、性别和菌株来代表鱼类种群。为了使用最小的动物数量, 屏幕环境的技术也详细。聚合酶链反应 (PCR) 在表面废油坑拭子是用来显着改善检测一些流行和致病杆菌物种, 如分枝杆菌杆菌, 分枝杆菌 haemophilum, 和龟分枝杆菌。另一种环境方法是处理在贮水池底部的污泥, 以寻找毛白杨卵。这是一种廉价和快速的技术, 可以应用在检疫的饲养设备被淹没在进口动物的控股罐。最后, 将 PCR 技术应用于污泥样品, 并在底池和表面检测到水气。一般来说, 这些特定的病原体的环境筛选技术, 比起前过滤哨兵的测试, 更敏感。
为了保护研究和动物福利1,2, 在动物设施内监测病原体的存在。在斑马鱼, 健康监测3,4,5,6,7,8,9,10,11通常依赖于分析的动物尸检后的经病理组织学, 细菌培养, 或分子方法。仅检测菌落动物不是推荐的方法, 因为鱼的数量和相关的费用将被要求检测低发病率的病原体。因此, 首选的方法是将一小群动物暴露在更高的污染物负荷中。这些鱼被称为预过滤哨兵。这种暴露持续了几个月, 它涉及增加动物看护人的工作量和/或一些专门建造的工程解决方案。另一项挑战是, 在检疫中筛选出可育的动物要保持活力的进口线, 这与对胴体的常规化验不相容。
我们在这里描述了一些方法来检测某些斑马鱼病原体 (水气, 分枝杆菌, 和毛白杨) 通过筛选水生系统的环境。目的是减少用于健康监测的鱼的数量, 并优化检测的营业额、成本和灵敏度。这种方法是一种替代动物的使用, 一些技术可以用于甄别进口的检疫。例如, 马可9能够通过在水池拭子上进行 PCR 而不是斑马鱼 (包括哨兵) 来识别更多的致病杆菌物种, 这是以较少的样本获得的。在同一研究中, 利用浮选和显微显微镜对坦克污泥进行筛选, 而不是通过 PCR 和组织病理学检测鱼, 来检测出更敏感的毛白杨卵。
表 1概述了哨兵程序的各种特征345,6789用于许多斑马鱼设施。后过滤哨兵接收水的方式与任何殖民地的鱼一样, 而预过滤哨兵接收水一旦它已经通过殖民地的鱼缸首先。例如, 可以在循环系统上设置预过滤哨兵, 不断接收污水坑水。这可能不是一个选项, 当有许多独立的系统在一个房间。在这种情况下, 一罐预过滤哨兵可以用来屏蔽整个房间。哨兵是在一个静态的坦克, 出循环系统, 他们的水是定期改变, 只使用预过滤水即, 从所有的系统在房间的污水。该技术被描述为与环境筛选效果比较的基线。该建议的设置是为了控制水质问题, 如降低 pH 值或氮污染。
细菌环境筛选的概念依赖于这样的假说, 即细菌在生物膜中被发现, 如在水表面的污水坑壁上或在罐底的污泥中找到。在循环养殖系统中, 水池似乎是一个理想的取样点, 因为它从所有的罐前过滤器收集废物 (水、粪便、饲料和其他有机物)。水池的表面经常容易地是可到达的, 抽汲是快速的, 并且它可以执行菌避免样品的交叉污秽 (从手套例如)。该概念用于鉴别斑马鱼系统中常见的致病性分枝杆菌9,12。下面介绍了该技术, 我们还报告了斑马鱼水槽表面拭子和污泥中的水气检测。
对寄生虫卵进行环境筛选是基于默里et al.的检测13和浮选技术是常规用于寄生虫和粪便中寄生虫卵的显微筛选14。马可9提出了一种替代取样过程的方法, 并表明该技术可用于检测鱼类群落生境的其他种类。感染的D. 鱼通过P. 毛白杨将它们的粪便和虫卵留在池底的污泥中。它们可以在那里收集, 因为它们的密度大于水。鸡蛋的密度也用来处理环境样品。第一次浮选与离心分离水和轻的残骸从重的物质。第二次离心依赖于饱和糖溶液 (密度大于密度的毛白杨卵), 允许寄生虫卵出现在试管的表面。
通过对第一次离心后获得的污泥样品进行 PCR, 对生物膜中的细菌和罐底的毛白杨进行筛选。这优化了取样时间。该方法如下所述。我们还建议在隔离环境中使用这些技术。为了屏蔽进口的成年斑马鱼 , 需要保持活着 , 一个育种装置入到检疫坦克。一周后, 在育种装置中的粪便和其他废弃物的收集和筛选通过显微镜或 PCR。下面介绍了该技术, 并在这方面显微镜检测到一些毛白杨卵。
技术、关键步骤和疑难解答的限制:
哨兵的年龄、性别、应变和暴露时间不规范。这在表 1中显示。在6月龄以下的鱼类或老鱼的筛查很少。可能有一些病原体影响幼鱼, 因为有一些病原体是较常见的在老年人口10,18,19,20。同样, 在某些哨兵组的选择中也没有考虑到性别问题, 尽管有些报告说某些病原体存在性别偏见21。建议的技术试图解决这些问题, 虽然应变的选择可以根据特定的病原体进行监测。例如, TU 可以帮助检测分枝杆菌,12,22, 但有一个风险, 哨兵将作为一个水库或显示临床症状。关于曝光时间的长短, 斑马鱼国际资源中心的做法10增加了检测病原体的几率, 而这些病菌在污染期内可能会被遗漏。长期暴露的需要意味着哨兵不容易获得。添加的环境样品允许一些灵活性和增殖的筛选事件。例如, 取样可以每隔一个月进行一次, 每次筛选方法间隔4月。这可能会减少在新引入的病原体被检测之前的时间的流逝。
环境筛选技术依赖于对环境中病原体的检测。病原体由鱼流下, 因此在系统水中稀释。没有探讨通过水过滤来捕获病原体的可能性23 。我们所描述的方法只有当病原体有足够的时间在鱼和生物膜上繁殖以达到允许检测的污染阈值时才有效。通过对取样点的关键选择, 将这种技术的限制降到最低限度: 对罐内的污泥进行取样, 而不是在废油坑污泥中取样, 而水和生物膜则是在污水坑的表面采样, 而不是在罐内或后过滤。尽管如此, 同一系统中的所有样本都不可能提供相同的结果。使用另一种方法 (组织病理学、PCR 或污泥分析) 可以证实对毛白杨的阳性结果。杆菌 PCR 阳性结果可以通过培养或其他诊断实验室确认。然而, 在建立健康状况时, 建议进一步的样本, 以确认任何环境筛选技术的负面结果。
技术在现有/替代方法方面的重要性:
分枝杆菌在环境中是常见的, 它们在污水坑中的存在并不能预测其致病性12。马可9表明, 监测死亡率是调查健康问题发展的关键。动物标本的使用对任何兽医调查都是必不可少的。健康监测意味着在一个设施中检测所有流行的病原体, 而这不能仅仅通过环境筛选技术来实现。然而, 缺乏灵敏度的诊断工具可以延缓或防止准确描述健康状况。虽然哨兵的使用减少了检测在人群中流行的微生物所需的鱼的数量, 但是缺乏敏感性增加了使用多种方法的重量, 包括环境筛选5,23。事实上, 特定的病原体自由状态通常被定义为在设施中缺少一个物种, 这样环境和动物样本必须测试负的24,25。
该水池拭子的结果, 以确定分枝杆菌, 表明, 依赖于鱼类样本可能会导致一个虚假的负面健康状况。6试验过的杆菌种被描述为斑马鱼的致病或潜在致病性15 , 有些不会被鸡蛋表面消毒, 氯26在检疫中例行执行。因此, 伪负可能会对导入行的协作者产生一定的影响。例如, m 杆菌在鱼样本上被 pcr 遗漏, 但超过一半的废油坑棉签 pcr 检测到它。考虑到这些分枝杆菌对氯的耐药性比其他人多, 而且它们在水系统中的生长能力27, 这是不受污染的进口设施的风险。为了允许导入行, 经理需要信任和比较出口设施的健康报告与他们的。委员会性能评估程序28是啮齿类动物过程中的关键。RESAMA 网络报告法语D. 鱼11中的m gordonae和m mucogenicum的检测。这些分枝杆菌不是在我们使用的商业实验室的面板中提出的。这将是有用的扩展委员会程序和统一的诊断化验以及致病物种名单29。
水气也是一种病原体, 在导入动物时有可能被引入, 尽管它对氯气的敏感度30使其在常规的蛋表面消毒过程中更容易消除。水池, 棉签和污泥的结果表明, 环境筛选可以用来检测这种病原体。其他细菌如分枝杆菌在污泥中被检测到 PCR23。这种类型的样品是特别相关的, 因为它可以检测棚病原体。例如, 另一个新的应用是污泥分析筛检进口鱼在检疫为P. 毛白杨。寄生虫是威胁动物的健康13和肿瘤模型16。此外, 在常规斑马鱼蛋表面消毒中使用的氯浓度不是有效的31。因此, 以一周的营业额和没有任何鱼类安乐死来筛选进口动物的能力似乎很有吸引力。这种技术可以通过允许进口的分流来影响检疫和生物安全规则。然后根据出口设施中流行的病原体、进口鱼样本中检测到的病原体以及危害进口设施的健康状况的风险, 设计了一个决策过程10。
掌握这些技术后的未来应用或方向:
即使是常规的检疫治疗是选择的选择, 这种药物的功效32,33,34,35,36可以用育种装置的污泥分析评估。更普遍地, 环境筛选可以被用于测试化合物反对细菌和寄生虫根除, 包括在鱼群落生境。环境筛选的另一个利基应用是监测活饲料中的病原体的数量37,38。虽然这些技术的主要应用是作为一个宝贵的除了诊断工具箱的健康监测在斑马鱼设施。由于更准确, 成本和时间的有效定义的健康状况, 废油坑棉签和污泥分析是互补的哨兵监测和例行检疫的做法。事实上, 这些技术的未来将成为任何水生实验室健康报告的例行部分。
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢弗朗西斯克里克研究所的 BRF 游泳队的技术帮助和关键投入。这项工作得到了弗朗西斯克里克研究所的支持, 它获得了癌症研究英国 (FC001999)、英国医学研究理事会 (FC001999) 和惠康信托基金 (FC001999) 的核心资助。
Aqua-Sed 250 mL | Vetark | 2-phenoxyethanol | |
Tubed Sterile Dryswab Tip | mwe | MW100 | Sump surface |
BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric | Becton Dickinson |
300866 | They are actually graduated to 60 ml |
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