Ce protocole décrit l’utilisation d’écouvillons de puisard et les analyses de boues des systèmes de poisson-zèbre, qui conduit à la détection accrue par rapport à l’usage exclusif des sentinelles pour détecter des agents pathogènes comme Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. et Pseudocapillaria tomentosa. Un système de surveillance des œufs P. tomentosa en quarantaine est également proposé.
Systèmes de surveillance de la santé sont développés et utilisés dans les installations de recherche de poisson-zèbre parce que les agents pathogènes des Danio rerio comme Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. et Pseudocapillaria tomentosa ont le potentiel de entraver la recherche et le bien-être animal. Les poissons sont généralement analysés post-mortem pour détecter les microbes. L’utilisation d’animaux sentinelles est un moyen proposé pour améliorer la sensibilité de la surveillance et de réduire le nombre d’animaux à échantillonner. Le réglage d’un réservoir de préfiltration sentinelles d’un système de recirculation est décrite. La technique est développée pour prévenir la pollution des eaux et de représenter la population de poissons par une sélection rigoureuse de l’âge, le sexe et les souches. Afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux, techniques de l’environnement de l’écran sont également détaillés. Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) sur écouvillons puisard surface sert à améliorer significativement la détection de certaines espèces de mycobactéries pathogènes et répandu comme Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumet Mycobacterium chelonae. Une autre méthode environnementale se compose de traitement des boues au fond d’un réservoir d’eaux noires ou un puisard pour chercher des oeufs P. tomentosa . Il s’agit d’une technique rapide et bon marchée qui peut être appliquée en quarantaine où un dispositif de reproduction est immergé dans le réservoir d’animaux importés. Enfin, la PCR est appliquée à l’échantillon de boues et a. hydrophila est détecté au fond de la fosse et la surface. En règle générale, ces techniques d’examen environnemental préalable appliquées à ces pathogènes spécifiques ont conduit à une sensibilité accrue par rapport aux essais des sentinelles de préfiltration.
Afin de protéger la recherche et le bien-être des animaux1,2, la présence d’agents pathogènes est surveillée dans les animaleries. Dans le cas du poisson-zèbre,3,4,5,6,7,8,9,10,11 de contrôle d’intégrité s’appuie souvent sur animaux analysé post-mortem par histopathologie, la culture de la bactériologie ou des méthodes moléculaires. Seule colonie d’animaux n’est pas la méthode recommandée en raison du nombre des poissons et des dépenses qui seraient nécessaires pour détecter les agents pathogènes de faible prévalence. Par conséquent, la méthode recommandée consiste à exposer un petit groupe d’animaux à une charge plus élevée de contaminants. Ces poissons sont aussi appelés sentinelles avant la filtration. Cette exposition dure pendant des mois et il s’agit d’une augmentation de la charge de travail pour le soignant animale et/ou une solution d’ingénierie construite à cet effet. Un autre défi est la projection de lignes importées en quarantaine où les animaux fertiles sont à être maintenue en vie, et ce n’est pas compatible avec des tests de routine sur les carcasses.
Nous décrivons ici quelques méthodes pour détecter certains agents pathogènes du poisson-zèbre (a. hydrophila, Mycobacterium spp. et P. tomentosa) en projetant d’environnement du système aquatique. L’objectif est de réduire le nombre de poissons utilisés pour la surveillance de la santé et à optimiser le chiffre d’affaires, coût et la sensibilité de la détection. Ces méthodes sont une alternative à l’utilisation des animaux et certaines techniques peuvent être appliquées aux importations de dépistage en quarantaine. Par exemple, Mocho9 a permis d’identifier plusieurs espèces de mycobactéries pathogènes en effectuant la PCR sur écouvillons puisard plutôt que le poisson-zèbre (y compris les sentinelles), et cela a été obtenue avec moins d’échantillons. Dans ce même étude, P. tomentosa oeufs ont été détectés avec plus de sensibilité en projetant les boues de réservoir à l’aide de microscopes et flottation plutôt que test poissons par PCR et l’histopathologie.
Le tableau 1 résume les différentes caractéristiques des sentinelles programmes3,4,5,6,7,8,9,10 utilisé par un certain nombre d’installations de poisson-zèbre. Après filtration sentinelles reçoivent de l’eau de la même manière que n’importe quel poisson de la colonie alors que sentinelles de préfiltration reçoivent de l’eau une fois qu’il a distribué à travers les aquariums colonie tout d’abord. Par exemple, préfiltration sentinelles peuvent être mis en place sur le système de recirculation en recevant en permanence l’eau Carter. C’est peut-être pas une option quand il y a beaucoup de systèmes indépendants dans la même pièce. Dans ce cas, un réservoir de préfiltration sentinelles peut être utilisé pour dépister toute la salle. Les sentinelles sont dans un réservoir statique, hors du système de recirculation, et leur eau est changée régulièrement, utilisant uniquement l’eau avant la filtration c’est-à-dire, eau de carter de vidange de tous les systèmes dans la salle. Cette technique est décrite ci-dessous comme point de référence pour la comparaison avec l’efficacité de l’examen environnemental préalable. L’aménagement proposé est conçu pour contrôler les problèmes de qualité de l’eau comme une diminution de pH ou une pollution par l’azote.
Le concept de l’examen préalable bactérienne s’appuie sur l’hypothèse que les bactéries sont détectables dans le biofilm tel que celui trouvé sur le mur de puisard à la surface de l’eau ou dans la boue au fond d’un réservoir. Le puisard semble un point de prélèvement idéal dans un système à recirculation aquaculture puisqu’il recueille les déchets (eau, matières fécales, aliments pour animaux et autres matières organiques) de tous les réservoirs avant la filtration. La surface de la fosse est souvent facilement accessible, le pistonnage est rapide, et elle peut être réalisée de façon aseptique pour éviter la contamination croisée de l’échantillon (à partir de gants par exemple). Le concept sert à identifier répandue pathogènes Mycobacterium spp. du poisson-zèbre systèmes9,12. La technique est décrite ci-dessous, et nous rendons compte également la détection d’a. hydrophila dans le poisson-zèbre puisard surface écouvillons et boues.
L’examen environnemental préalable pour les oeufs de parasite est basé sur la détection de Murray et al. 13 et la technique de flottation est utilisé systématiquement pour la parasitologie et dépistage microscopique des oeufs de parasite dans les selles,14. Mocho9 propose une alternative au processus d’échantillonnage et a montré que la technique pourrait être utilisée pour détecter les autres espèces du biotope poissons. Infectés d. rerio passer P. tomentosa oeufs avec leurs excréments et les œufs de parasites restent au fond de la citerne, dans la boue. Ils peuvent être récoltés là en raison de leur densité étant supérieure à l’eau. La densité des oeufs est utilisée pour traiter l’échantillon environnemental trop. Une première émission avec centrifugation sépare l’eau et les débris légers de matière plus lourd. Une seconde centrifugation s’appuie sur la solution saturée de sucre (avec une densité supérieure à la densité des oeufs P. tomentosa ) afin de permettre les oeufs du parasite à émerger à la surface du tube.
Le dépistage de bactéries présentes dans le biofilm et de P. tomentosa du fond de la citerne peut être combiné en effectuant des PCR pour tous ces agents pathogènes sur les sédiments d’échantillon de boues obtenues après la première centrifugation. Cela optimise le temps d’échantillonnage. La méthode est décrite ci-dessous. Nous proposons également d’utiliser ces techniques dans un contexte de mise en quarantaine. Pour importé poisson-zèbre adulte nécessitant d’être maintenu en vie de l’écran, un appareil de reproduction est inséré dans le réservoir de la quarantaine. Après une semaine, excréments et autres déchets dans l’appareil de reproduction sont recueillies et examinées par microscopie ou PCR. La technique est décrite ci-dessous et quelques oeufs P. tomentosa ont été détectés par microscopie dans ce contexte.
Limites des Techniques, des étapes critiques et le dépannage :
L’âge, le sexe, souche et durée de l’exposition des sentinelles ne sont pas normalisées. Ceci est illustré dans le tableau 1. Il y a très peu de projection du poisson au-dessous de 6 mois d’âge ou de poissons âgés. Il peut y avoir certains pathogènes qui affectent les jeunes poissons, étant donné que certains agents pathogènes qui sont plus répandus dans les populations âgées10,18,19,20. De même, le sexe n’est pas considéré dans le choix de certains groupes de sentinelle malgré certaines disent qu’il y a un parti pris sexiste pour certains agents pathogènes21. La technique proposée tente de résoudre ces problèmes, bien que le choix de la souche pourrait être fait selon un agent pathogène spécifique pour surveiller. Par exemple, TU pourrait aider à la détection de Mycobacterium spp.12,22, mais il existe un risque que les sentinelles puis agirait comme un réservoir ou affichage des signes cliniques. Quant à la durée d’exposition, l’approche du poisson-zèbre International Resource Center10 augmente les chances pour détecter les agents pathogènes qui pourraient manquer avec une période de contamination inadéquate. La nécessité d’une exposition prolongée implique que les sentinelles ne sont pas facilement disponibles. L’inscription des échantillons environnementaux permet une certaine souplesse et la multiplication des événements dépistage. Par exemple, le prélèvement peut avoir lieu tous les deux mois à 4 mois d’intervalle entre chaque méthode de dépistage. Cela peut réduire le laps de temps avant un nouveau pathogène est détecté.
Les techniques d’examen environnemental préalable s’appuient sur la détection de pathogènes dans l’environnement. Les agents pathogènes sont répandus par les poissons et donc dilués dans l’eau du système. La possibilité de capturer les agents pathogènes par filtration de l’eau23 n’a pas explorée. Les méthodes que nous décrivons sont efficaces seulement si les agents pathogènes sont donnés assez de temps pour se multiplier dans les poissons et le biofilm pour atteindre un seuil de contamination permettant la détection. Cette limitation des techniques est minimisée par une sélection critique des sites d’échantillonnage : la boue contenue dans le réservoir est échantillonnée plutôt que de la boue de Carter, et l’eau et le biofilm sont échantillonnés à la surface du bac, plutôt que dans un réservoir ou après filtration. Néanmoins, tous les échantillons provenant du même système sont peu susceptibles de donner les mêmes résultats. Des résultats positifs pour P. tomentosa peuvent être confirmées en utilisant un autre dosage (histopathologie, PCR ou analyse de boues). Mycobactéries résultats positifs de la PCR peuvent être confirmés par culture ou par un autre laboratoire de diagnostic. Cependant, lorsqu’il établit un état de santé, autres échantillons sont recommandés pour confirmer les résultats négatifs de toute technique d’examen environnemental préalable.
Importance de la Technique en ce qui concerne les méthodes existantes/Alternative :
Mycobacterium spp sont communs dans l’environnement et leur présence dans le carter ne prédit pas leur pathogénicité12. Mocho9 a montré que la surveillance des taux de mortalité est clé pour étudier l’évolution des problèmes de santé. L’utilisation d’échantillons de l’animales demeure indispensable à toute enquête vétérinaire. Surveillance de la santé implique la détection de tous les pathogènes répandues dans un établissement et cela ne peut être atteint avec l’utilisation exclusive de techniques d’examen environnemental préalable. Néanmoins, un manque de sensibilité des outils de diagnostic peut retarder ou empêcher une description précise de l’état de santé. Tandis que l’utilisation d’animaux sentinelles réduit le nombre de poissons pour détecter un microbe répandu dans la population, le manque de sensibilité ajoute du poids à l’aide d’une combinaison de méthodes, y compris l’examen environnemental préalable5,23. En effet le statut d’agent pathogène spécifique gratuit est généralement défini comme l’absence d’une espèce dans l’installation telles que les échantillons de l’environnementales et des animaux doivent tester négatif24,25.
Les résultats d’écouvillon puisard pour identifier Mycobacterium spp. montrent qu’en s’appuyant sur les poissons des échantillons peuvent conduire à un statut de faux négatifs sur la santé. Les 6 espèces de mycobactéries testés sont décrits comme pathogène ou potentiel pathogène chez le poisson zèbre15 et certains ne serait pas éliminée par la désinfection des surfaces oeuf avec chlore26 aussi assurée en quarantaine. Par conséquent, le faux négatif peut avoir des conséquences pour les collaborateurs qui importent des lignes. Par exemple, M. fortuitum n’est pas respectée par la PCR sur des échantillons de poisson mais plus de la moitié de l’écouvillon de puisard PCR détecté. Considérant que ces mycobactéries sont plus résistants au chlore que d’autres et leur aptitude à croître dans les réseaux d’aqueduc27, c’est un risque pour l’installation d’importation non contaminé. Pour permettre l’importation de lignes, les gestionnaires doivent faire confiance et de comparer les rapports sur la santé du Fonds pour l’exportation avec les leurs. L’ ICLAS Performance Evaluation Program28 est essentielle à ce processus chez les rongeurs. Le réseau RESAMA rapporte la détection de M. gordonae et M. mucogenicum en Français d. rerio11. Ces mycobactéries ne sont pas proposées dans les panneaux des laboratoires commerciaux que nous utilisons. Il serait utile de prolonger le programme de l’ICLAS et d’harmoniser les épreuves diagnostiques ainsi que la liste des espèces pathogènes29.
A. hydrophila est aussi un pathogène qui a le potentiel pour être présenté lors de l’importation d’animaux, bien que sa sensibilité au chlore30 rend son élimination plus probable au cours de la désinfection des surfaces oeuf systématique. Le puisard, écouvillon et boues résultats montrent que l’examen environnemental préalable peut être utilisé pour détecter ce pathogène. Autres bactéries comme Mycobacterium spp. ont été détectés dans la boue par PCR23. Ce type d’échantillon est particulièrement pertinent car il permet la détection de pathogènes de hangar. Par exemple, une nouvelle application est l’analyse de boues pour dépister les poissons importés en quarantaine P. tomentosa. Le parasite est une menace pour la santé d’animal13 et néoplasie de modèles16. Par ailleurs, les concentrations de chlore utilisées dans la désinfection des surfaces courantes de poisson-zèbre oeuf ne sont pas efficace31. La capacité à l’écran les animaux importés avec un chiffre d’affaires d’une semaine et sans aucune euthanasie poissons semble donc très attrayante. Cette technique peut influencer les règles de quarantaine et de la biosécurité en permettant à un triage des importations. Un processus décisionnel est alors conçu selon les pathogènes répandues dans l’installation de l’exportateur, les pathogènes détectés dans les échantillons provenant du poisson importé et le risque de compromettre l’état sanitaire de l’importateur installation10.
Les Applications futures ou Directions après la maîtrise de ces Techniques :
Même si le traitement de quarantaine systématique est l’option choisie, l’efficacité de ces médicaments32,33,34,35,36 pouvant être évaluée par l’analyse de boues de dispositif de reproduction. Plus généralement, l’examen environnemental préalable pourrait servir à tester les composés contre les bactéries et les parasites éradication, notamment dans le biotope des poissons. Une autre application de niche de l’examen environnemental préalable consiste à surveiller la population du pathogène dans le live feed37,38. Bien que le principal de l’application de ces techniques est comme un atout précieux pour la boîte à outils de diagnostic pour la surveillance dans les établissements de poisson-zèbre de la santé. Grâce à un coût et un temps plus précis, définition efficace du statut sanitaire, écouvillons de puisard et analyse de boues sont complémentaires de la surveillance sentinelle et la pratique systématique de quarantaine. En effet, l’avenir de ces techniques est d’être une partie intégrante de tout rapport de santé laboratoire aquatique.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier l’équipe de natation de BRF de L¿Institut Francis Crick pour leur aide technique et l’apport critique. Ce travail a été soutenu par l’Institut de Crick Francis qui reçoit son financement de base du Cancer Research UK (FC001999), le Medical Research Council du Royaume-Uni (FC001999) et le Wellcome Trust (FC001999).
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