Kinetikken for lagging-kjedet DNA Synthesis<em> In Vitro</em> Av bakteriofag T7 Replication Proteiner
Summary
We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Abstract
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
Introduction
Replikering av DNA er en konservert egenskap av alt cellenes liv. Mens identitet og antall replikasjonskomponenter varierer mye, blir de generelle mekanismer delt på tvers av en evolusjon. Her beskriver vi gel-baserte, diskontinuerlig kinetiske eksperimenter, ved hjelp av radioaktive substrater, med sikte på å forstå kinetikken av lagging kjedet DNA-syntese in vitro av komponenter av T7 replisome. Replikasjon maskineri til bakteriofag T7 er meget enkel og består av bare fire proteiner (DNA polymerase den, GP5, og dens processivity faktor, E. coli tioredoksin, de bifunksjonelle primase-helikase gp4, og enkelt-trådet DNA bindende protein, GP2. 5) 2. Denne funksjonen gjør det til et attraktivt modellsystem for å studere konserverte biokjemiske mekanismene som er involvert i DNA replikasjon.
Det legges spesielt vekt på dannelsen av ribonukleotid primere av T7 DNA primase, en critical trinn i initiering av DNA-syntese. I tillegg kan man også undersøke bruken av disse primere av T7 DNA-polymerase eller en annen replikasjonsproteiner ved å inkludere dem i reaksjonsblandingen. T7-primase-helikase, gp4, katalyserer dannelsen av primere for DNA-syntese ved spesifikke DNA-sekvenser som kalles primase sider gjenkjennings, eller PRS, (5'-GTC-3 '). Den cytosin i PRS er kryptisk, det er viktig for anerkjennelse av området, men det er ikke kopiert inn i produktet 3. Det første trinnet i syntesen av primer gp4 involverer dannelsen av dinukleotid pppAC, som deretter utvides til en trimer, og til slutt til funksjons tetranukleotid primere pppACCC, pppACCA, eller pppACAC avhengig av sekvensen i malen 4. Disse primere kan deretter brukes av T7 DNA-polymerase for å initiere DNA syntese, som også er en gp4 assistert prosess 5, 6. I denne forbindelse, primasedomene stabiliserer ekstremt korte tetraribonucleotides med malen, hindrer deres dissosiasjon, engasjerer DNA polymerase på en måte som bidrar til å sikre primer / mal i polymerase aktive området 7. Disse trinnene (RNA primer syntese, primer overlevering til polymerase, og forlengelse) blir gjentatt i flere sykluser for å gjenskape lagging strand og må koordineres med replikering av de ledende tråden.
Analysene beskrevet her er meget følsomme og kan utføres i et moderat tidsrom. Men de er relativt lav gjennomstrømning og stor forsiktighet må utøves i bruk og deponering av radioaktivt materiale. Avhengig av hastigheten ved hvilken reaksjonen skrider frem, kan man anvende et hurtigavkjølingsapparatet for å oppnå prøver ved tidsskalaer mottagelig for meningsfull analyse av reaksjons tidsforløp i enten stabil eller pre-stabil tilstand. Nylig har vi brukt analyser som er beskrevet her for å gi evidence av betydningen av primeren frigjøring fra primase domene av gp4 i initiering av Okazaki-fragmenter. I tillegg har vi funnet bevis for en regulatorisk rolle for T7-enkelt-trådet DNA bindende protein, gp2.5, for å fremme effektiv primer dannelse og utnyttelse 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den viktigste faktoren i å utføre disse forsøkene er tilgjengeligheten av høyaktiv renset enzym. Under vårt arbeid med gp4, for eksempel, har vi funnet at lagring av det rensede enzym i buffer (20 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) inneholdende 50% glycerol ved -20 ° C fører til en reduksjon i den spesifikke aktiviteten av preparatet i løpet av et par måneder. Derfor har vi nå flash-fryse små alikvoter av renset gp4 i 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCEP, og 10% glycerol ved…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Materials
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA replication. , (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
