Solea Senegalensis शुक्राणु में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के Intracellular स्थान का मूल्यांकन
Summary
इस प्रोटोकॉल का पता लगाने के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन करता है H2O2 स्थानीयकरण के भीतर Solea senegalensis शुक्राणु का उपयोग कर एक संवेदनशील fluorochrome DCFH के लिए-DA, ROS के लिए एक जीवित mitochondria दाग mitochondria के लिए, और DAPI नाभिक के लिए दृश्य, क्रमशः । प्रोटोकॉल के लिए या तो ताजा या गल शुक्राणु के साथ 2 घंटे के भीतर प्रदर्शन किया जा बनाया गया है ।
Abstract
ऑक्सीडेटिव तनाव शुक्राणु की गुणवत्ता को कम करने में महत्वपूर्ण कारकों में से एक है । शुक्राणु में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का पता लगाने के लिए कुशल प्रोटोकॉल का विकास करना किसी भी प्रजाति में उच्च महत्व का है, लेकिन इन तरीकों का शायद ही कभी उपयोग किया जाता है और teleost में भी कम । Cryopreservation विभिंन प्रयोजनों के लिए जलीय कृषि में एक उपयोगी तकनीक है, जीन बैंकिंग और गारंटी शुक्राणु उपलब्धता सहित साल भर । ठंड/गल प्रक्रियाओं ROS उत्पादन और शुक्राणु कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है । भावी क्षति को ध्यान में रखते हुए कि ROS उत्पादन के एक अतिरिक्त शुक्राणु में अपने स्थानीयकरण के आधार पर हो सकता है, यहां एक विस्तृत पद्धति एच2ओ2 का पता लगाने और फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा अपनी intracellular स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए उपलब्ध कराई गई है । इस प्रयोजन के लिए, 3 fluorochromes (2 ′, 7 ′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), एक लाइव mitochondria दाग और 4 ‘, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)) का संयोजन करने के लिए एच2ओ 2 के सह-स्थानीयकरण का मूल्यांकन किया जाता है शुक्राणु नाभिक या mitochondria में Solea senegalesis शुक्राणु के नमूनों के साथ ।
Introduction
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन शुक्राणु की गुणवत्ता के साथ हाल ही में जोड़ा गया है1। हालांकि mitochondria में ROS उत्पादन एक सामांय शारीरिक प्रक्रिया माना जा सकता है, ROS उत्पादन की एक अतिरिक्त द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव विभिंन स्तरों पर शुक्राणु में नुकसान का एक स्पष्ट कारण है । मनुष्यों में, ऑक्सीडेटिव तनाव पुरुष बांझपन के साथ जुड़ा हुआ है, फेरबदल गतिशीलता और क्षमता से गुजरना करने के लिए2; स्तनधारी, जमे हुए शुक्राणु नमूनों में डीएनए अखंडता के परिवर्तन भी एच2हे23के संश्लेषण से संबंधित किया गया है ।
Cryopreservation जलीय कृषि में जीन बैंकिंग के लिए एक आम तकनीक है । यह तकनीक Solea senegalensisजैसी प्रजनन समस्याओं के साथ प्रजातियों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । बाजार में इस मूल्यवान प्रजातियों अदालत की कमी के कारण कैद में पैदा हुए व्यक्तियों में प्रजनन रोग से पता चलता है । इस तथ्य को शुक्राणु cryopreservation कृत्रिम निषेचन के लिए शुक्राणु की उपलब्धता आवश्यक बनाता है । हालांकि, cryopreservation ऑक्सीडेटिव तनाव का एक स्रोत है कि शुक्राणु4 के लिए हानिकारक हो सकता है के रूप में अध्ययन एंटीऑक्सीडेंट पूरकता का एक लाभकारी प्रभाव की सूचना दी है हो सकता है । mitochondrial के माध्यम से ROS निषेध-लक्षित एंटीऑक्सीडेंट पीला कैटफ़िश में शुक्राणु cryopreservation के लिए कथित तौर पर फायदेमंद था5.
इसलिए, शुक्राणु के नमूनों में ROS के स्तर को जानने के लिए महत्वपूर्ण हैं, विशेष रूप से cryopreservation के बाद6,7 क्योंकि इन अणुओं शुक्राणु अस्तित्व और प्रजनन8के लिए एक खामी के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है । इसके अलावा, सेल के भीतर ROS के वितरण का अध्ययन करने के लिए संभावित नुकसान के स्तर का अनुमान महत्वपूर्ण हो सकता है । एक उदाहरण के रूप में, mitochondria में ROS के निंन स्तर सामांय और शुक्राणु समारोह के साथ संगत ग्रहण किया जा सकता है, लेकिन नाभिक के भीतर ROS के उच्च स्तर शुक्राणु डीएनए क्षति के संकेतक हो सकता है । एच2हे2 सबसे अधिक प्रासंगिक ROS में से एक है कि mitochondria से जारी किया जा सकता है और नाभिक घुसना क्योंकि यह एक छोटे और आरोप कम अणु9है । Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) विशेष रूप से हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जक intracellular पेरोक्साइड प्रकट कर सकते हैं । इस अनुच्छेद में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल का पता लगाने के लिए एच2ओ2 intracellular स्थानीयकरण Solea senegalensis में फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्रस्तुत किया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह सर्वविदित है कि mitochondria शुक्राणु गतिशीलता और समारोह के लिए महत्वपूर्ण organelles हैं । इन organelles ROS उत्पादन में समवर्ती सीधे शामिल हैं । दिलचस्प है, ROS के नियंत्रित स्तर उचित शुक्राणु समारोह1के लिए आवश्य?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम AQUAGAMETE एफए १२०५ लागत कार्रवाई का शुक्र है । यह कार्य वित्तीय रूप से AGL201568330-C2-1-R परियोजना (MINECO/FEDER) द्वारा समर्थित था । डेविड जी Valcarce जंटा de Castilla y León (EDU1084/2012) और Fondo सामाजिक Europeo द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखक डॉ एना Riaza और Stolt सागर फार्म S.A., डॉ Paulino de पाज़, डॉ Ignacio मार्टिनेज Montero और जोस रामोन Guiérrez स्वीकार करते हैं । हम भी वीडियोग्राफी के लिए पाउला Fernández Colado धंयवाद ।
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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