Valutazione della posizione intracellulare di specie reattive dell'ossigeno in spermatozoi Solea Senegalensis
Summary
Questo protocollo descrive una dettagliata metodologia per la rilevazione di localizzazione di H2O2 all’interno di spermatozoi, Solea senegalensis utilizzando un fluorocromo sensibile DCFH-DA ROS, una macchia di mitocondri dal vivo per i mitocondri, e DAPI per nuclei visualizzazione, rispettivamente. Il protocollo è progettato per essere eseguito all’interno di 2 h con gli spermatozoi o freschi o scongelati.
Abstract
Lo stress ossidativo è uno dei fattori importanti nel fare diminuire la qualità dello sperma. Lo sviluppo di efficienti protocolli per la rilevazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) degli spermatozoi è di grande importanza in tutte le specie, ma questi metodi sono utilizzati raramente e ancor meno nel teleosteo. Crioconservazione è una tecnica utile in acquacoltura per scopi diversi, comprese le operazioni di gene e garantita disponibilità di sperma durante tutto l’anno. Procedure di congelamento/scongelamento potrebbe causare la produzione di ROS e danneggiare le cellule dello sperma. Considerando i potenziali danni che un eccesso di produzione di ROS potrebbe causare degli spermatozoi a seconda della loro localizzazione, qui una dettagliata metodologia per rilevare H2O2 e per valutare la localizzazione intracellulare mediante microscopia confocale è fornito. Per questo scopo, una combinazione di 3 fluorocromi (2 ′, 7 ′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA), una macchia di mitocondri dal vivo e 4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI)) vengono utilizzati per valutare la co-localizzazione di H2O2 con nuclei di spermatozoi o mitocondri nei campioni di sperma di Solea senegalesis .
Introduction
La produzione di specie reattive dell’ossigeno è stata collegata con la qualità dello sperma di recente1. Anche se la produzione di ROS nei mitocondri può essere considerata un normale processo fisiologico, lo sforzo ossidativo da un eccesso di produzione di ROS è una chiara causa di danno negli spermatozoi a diversi livelli. In esseri umani, lo sforzo ossidativo è associato con infertilità maschile, alterando la motilità e la capacità di subire capacitazione2; nei mammiferi, cambiamento dell’integrità del DNA nei campioni di seme congelato è stata anche collegata alla sintesi di H2O23.
Crioconservazione è una tecnica comune per gene bancaria in acquacoltura. Questa tecnologia è particolarmente importante nelle specie con problemi riproduttivi quali Solea senegalensis. Questa specie di valore nel mercato mostra disfunzione riproduttiva in individui nati in cattività a causa della mancanza di corteggiamento. Questo fatto rende necessario avere disponibilità di spermatozoi per la fecondazione artificiale crioconservazione degli spermatozoi. Tuttavia, la crioconservazione potrebbe essere una fonte di stress ossidativo che potrebbe essere dannoso per gli spermatozoi4 come studi hanno segnalato un effetto benefico del completamento antiossidante. Inibizione di ROS attraverso antiossidante mitocondriale-mirato è stato riferito di essere benefico per la crioconservazione di spermatozoi in pesce gatto giallo5.
Di conseguenza, i livelli di ROS nei campioni di sperma sono importanti per sapere, in particolare dopo crioconservazione6,7 perché queste molecole sono state riconosciute come uno svantaggio per la sopravvivenza dello sperma e fertilità8. Inoltre, studiando la distribuzione dei ROS all’interno della cellula potrebbe essere cruciale per dedurre il livello di danno potenziale. Ad esempio, i bassi livelli di ROS nei mitocondri potrebbero essere presupposto normale e compatibile con la funzione dello sperma, ma alti livelli di ROS all’interno del nucleo potrebbero essere indicatori di danno del DNA degli spermatozoi. H2O2 è uno dei più rilevanti ROS che potrebbe essere rilasciato dai mitocondri e penetrare nel nucleo, perché si tratta di una molecola piccola e carica-meno9. Diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) può rivelare specificamente perossido intracellulare che emette fluorescenza verde. In questo articolo, è presentato un protocollo dettagliato per individuare la localizzazione intracellulare di H2O2 nel Solea senegalensis sperma usando la microscopia confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
È noto che i mitocondri sono organelli chiavi per motilità dello sperma e la funzione. Questi organelli sono contemporaneamente direttamente coinvolti nella produzione di ROS. È interessante notare che, controllati i livelli di ROS sono necessari per lo sperma corretta funzione1. Relazioni positive tra fertilità e stress ossidativo sono state indicate in mammiferi11 ma livelli eccessivi influenzano sperma qualità12. Un fattore cruciale che potre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce è stato finanziato dalla Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) e Fondo sociale Europeo. Gli autori riconoscono Dr. Ana Riaza e Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero e José Ramón Guiérrez. Ringraziamo anche Paula Fernández Colado per videografia.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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