Avaliação da localização intracelular de espécies reativas de oxigênio em espermatozoides de Solea Senegalensis
Summary
Este protocolo descreve uma metodologia detalhada para detectar a localização de2 H2O dentro Solea senegalensis espermatozoides usando um fluorocromo sensível Diniz Melo-para ROS, uma mancha de mitocôndrias ao vivo para a mitocôndria e DAPI para núcleos visualização, respectivamente. O protocolo é projetado para ser realizada até 2 horas com espermatozoides descongelados ou frescos.
Abstract
Estresse oxidativo é um dos fatores importantes na diminuição da qualidade do esperma. Desenvolvimento de protocolos eficientes para a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) de espermatozoides é de grande importância em qualquer espécie, mas esses métodos são usados raramente e ainda menos em teleósteos. Criopreservação é uma técnica útil na aquicultura para diferentes finalidades, incluindo bancos de genes e disponibilidade de esperma ao longo do ano. Procedimentos de congelamento/descongelamento pode causar a produção de ROS e danificar as células de esperma. Considerando os potenciais danos que um excesso de produção de ROS poderia causar em espermatozoides, dependendo da sua localização, aqui uma metodologia detalhada para detectar H2O2 e avaliar sua localização intracelular por microscopia confocal é fornecido. Para este efeito, uma combinação de 3 fluorochromes (2 ′, diacetato de 7 ‘-Dichlorodihydrofluorescein (Diniz Melo-DA), uma mancha de mitocôndrias ao vivo e 4 ′, dicloridrato 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) são usados para avaliar a localização co de H2O2 com núcleos de espermatozoides ou mitocôndrias em amostras de esperma de Solea senegalesis .
Introduction
A produção de espécies reativas de oxigênio tem sido associada com a qualidade do esperma recentemente1. Embora a produção de ROS na mitocôndria pode ser considerada um processo fisiológico normal, estresse oxidativo, por um excesso de produção de ROS é uma clara causa de danos no espermatozoide em diferentes níveis. Em humanos, estresse oxidativo está associado com a infertilidade masculina, alterando a motilidade e a capacidade de se submeter a capacitação2; em mamíferos, alteração da integridade do DNA em amostras de esperma congelado tem sido também relacionada à síntese de H2O23.
Criopreservação é uma técnica comum para gene bancário na aquicultura. Esta tecnologia é particularmente importante em espécies com problemas reprodutivos como Solea senegalensis. Esta espécie valiosa no mercado mostra disfunção reprodutiva em indivíduos nascidos em cativeiro devido à falta de namoro. Este fato torna a criopreservação de esperma necessário ter disponibilidade de esperma para fertilização artificial. No entanto, criopreservação poderia ser uma fonte de estresse oxidativo que pode ser prejudicial para espermatozoides4 como estudos relataram um efeito benéfico da suplementação antioxidante. Inibição de ROS através de antioxidante mitocondrial-alvo foi supostamente benéfica para criopreservação de esperma em bagre amarelo5.
Portanto, os níveis de ROS em amostras de esperma são importantes para saber, particularmente após a criopreservação6,7 , porque estas moléculas foram reconhecidas como uma desvantagem para a sobrevivência de esperma e fertilidade8. Além disso, estudando a distribuição de ROS dentro da célula pode ser crucial para inferir o nível de dano potencial. Por exemplo, baixos níveis de ROS na mitocôndria poderiam ser assumidos normal e compatível com a função de esperma, mas altos níveis de ROS dentro do núcleo podem ser indicadores de danos de DNA de espermatozoides. H2O2 é um do mais relevante ROS que poderia ser libertado da mitocôndria e penetrar no núcleo, porque é uma molécula pequena e sem carga9. Diacetato de diclorofluoresceína (Diniz Melo-DA) especificamente pode revelar peróxido intracelular emitindo fluorescência verde. Neste artigo, é apresentado um protocolo detalhado para a detecção de H2O2 intracelular localização no esperma de Solea senegalensis usando microscopia confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
É sabido que as mitocôndrias são organelas chaves para motilidade espermática e função. Estas organelas estão simultaneamente diretamente envolvidas na produção de ROS. Curiosamente, níveis controlados de ROS são necessários para esperma adequado função1. Relações positivas entre fertilidade e estresse oxidativo tem sido demonstradas em mamíferos11 mas níveis excessivos afetam esperma qualidade12. Um fator crucial que pode ser decis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a AQUAGAMETE FA 1205 custo de ação. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projeto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce foi financiado pela Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) e Fondo Social Europeo. Os autores reconhecem a Dr. Ana Riaza e Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero e José Ramón Guiérrez. Agradecemos também a Paula Fernández Colado pela videografia.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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