Analysere Cell Surface Adhesjon Ombygging i Response til Mekanisk Tension Bruke magnetiske kuler

Summary

Celleoverflatevoksninger er sentrale i mechanotransduction, som de overfører mekanisk spenning og iverksette de signalveier involvert i vev homeostase og utvikling. Her presenterer vi en protokoll for å dissekere de biokjemiske mekanismer som aktiveres i respons til spenning, ved hjelp av ligand-belagt magnetiske mikroperler og kraft søknad til vedheft reseptorer.

Abstract

Mechanosensitive celleoverflate adhesjons komplekser tillate cellene å avføle de mekaniske egenskapene til sine omgivelser. Nyere studier har identifisert både kraft-sensing molekyler på vedheft områder, og tvinge avhengig transkripsjonsfaktorer som regulerer avstamning spesifikke genuttrykk og drive fenotypiske utganger. Imidlertid har signalnettverk konvertere mekanisk spenning i biokjemiske mekanismer vært unnvikende. For å utforske de signalveier som driver etter en mekanisk spenning som er påført celleoverflatereseptor, kan superparamagnetiske mikrokuler anvendes. Her presenterer vi en protokoll for å bruke magnetiske kuler for å bruke kreftene til celleoverflate adhesjonsproteiner. Ved hjelp av denne metode, er det mulig å undersøke ikke bare kraftavhengig cytoplasmatiske signalbaner av forskjellige biokjemiske metoder, men også adhesjon remodellering av magnetisk isolasjon av adhesjons komplekser festet til ligand-belagte kuler. Denne protokollen innbefatter fremstilling av ligand-corerte superparamagnetiske perler, og anvendelse av definere strekkrefter fulgt av biokjemiske analyser. I tillegg tilbyr vi et representativt utvalg av data som viser at spenning påføres intebasert heft utløser heft ombygging og endrer protein tyrosin fosforylering.

Introduction

I metazoer, retning og mekanisk spenning vev utvikling og homeostase gjennom regulering av en myriade av cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering og overlevelse ^{1, 2.} Mekaniske spenninger kan oppstå fra den ekstracellulære matriks eller kan genereres av adherente celler, som prøve deres ekstracellulære miljø gjennom actomyosin kontraktile maskiner som trekker ut mot ekstracellulær matriks og sonder dens stivhet ved spenningsfølsomme molekyler. Som svar på spenning, mechanosensitive adhesjonsproteiner gjennomgå konformasjonsforandringer endringer som utløser komplekse signalkaskader. I sin tur, disse signalveier orkestrere en mechanoresponse omfatter spredning, differensiering og overlevelse som justerer cellulære atferd til det ekstracellulære miljøet. Slike prosesser kan bli avgjort i en kortsiktig periode (sekunder til minutter) for raskt å mate tilbake på løkken mecha notransduction ved å endre mechanosensitive strukturer. For eksempel, integrinbaserte voksn forsterke som reaksjon på spenning gjennom Rho GTPase-mediert cytoskeletal remodellering ^{3, 4, 5.} Parallelt er andre signalveier aktivert i løpet av timer og dager for å kontrollere genetiske programmer som til slutt påvirker celle skjebne ^6. Mens mange studier har fremhevet effekten av matrisen stivhet på celle determinisme og sykdomsutvikling ^{1, 2,} de nøyaktige molekylære mekanismer for vedheft-mediert mechanotransduction fortsatt unnvikende.

Ulike tilnærminger har blitt utviklet for å studere effekter av cellegenerert styrker eller ytre krefter på celle atferd, inkludert flytsystemer, fluorescens resonans energi overføring (FRET) -tension sensorer ^7,lass = "xref"> 8, kompatible underlag ^9, magnetiske pinsett, optiske pinsetter ¹⁰ og atomic force mikroskopi (AFM) ^11. Her presenterer vi en protokoll bruker superparamagnetiske perler å karakter mechanotransduction trasé som svar på strekkrefter brukt på bestemte vedheft reseptorer. Superparamagnetiske kuler er partikler som reversibelt magnetize når den plasseres i et magnetisk felt. Når belagt med en ligand for en spesifikk reseptor, disse perlene tilveiebringe et kraftig verktøy for å studere effektene av ekstracellulært kraftpåførings. Denne metoden har blitt validert av flere studier ^{3, 5, 12 – 17} og presentere fordel å i stor grad legge til rette for biokjemisk analyse på heftende celler. Ved hjelp av tilsvarende kollagen-belagte magnetiske kuler, etterfulgt av biokjemisk analyse, tidlige arbeid rapportert en økning iprotein-tyrosin-fosforylering og aktivering RhoA som reaksjon på spenning ^{5, 18, 19.} Metoden som beskrives nedenfor har også vært brukt med fibronektin (FN) -belagte perler for å karakterisere de signalveier nedstrøms fra spenning påføres integriner ^3. I denne studien Guilluy et al. viste at spenningen aktiverer RhoA gjennom rekruttering av de to guanin nukleotid utvekslings faktorer (GEFs), Larg og GEF-H1, til integrin vedheft komplekser. Siden det, har andre studier vist at GEF-H1 er rekruttert til vedheft komplekser som svar på celle-generert spenning ved hjelp av ulike metoder ^{20, 21,} demonstrere robustheten til metoden beskrevet her. Som et resultat ble aktivert RhoA vist seg å fremme vedheft forsterkning, gjennom cytoskeletal ombygging. Dette systemet ble også benyttet for å oppdage spenning påført to celle / celle adhesjon reseptorer. Anvendelse av krefter på magnetiske kuler belagt med det ekstracellulære domenet av E-cadherin induserte en økning i vinculin rekrutteringen på samme måte som integrin-assosierte adhesjons komplekser ^12. Collins og kolleger observerte at anvendelse av spenning til PECAM-en fremmer inte og RhoA aktivering ^13. En annen eksperimentell tilnærming ved hjelp av magnetiske kuler er studiet av spenning tilført til isolerte kjerner. Ved hjelp av kuler belagt med antistoffer mot kjernekapselproteinet nesprin-1, ble atom konvolutt komplekser renses for å vise at de er dynamisk regulert som respons på mekanisk spenning ^22. Disse resultatene støtter powerfulness av denne metoden i studiet av mechanotransduction veier. Videre, mens strømnings eller trekkraft systemer stimulere generelle cellulære prosesser, magnetiske kuler spesifikt mot en celle adhesjon reseptor ved hjelp av enten reseptorligander <sup class = "xref"> 3 eller monoklonale antistoffer mot celleoverflatereseptor ^{13, 15.}

En annen fordel med denne fremgangsmåte er isoleringen av adhesjons komplekser gjennom en enkel ligand affinitetsrensing prosedyre. Det er velkjent at tilsetning av ligand-belagte kuler til cellene binder adhesjonsreseptorer og induserer rekruttering av flere adhesjonsproteiner ^23. Ytterligere påføring av krefter til ligand-belagte magnetiske kuler svinger disse adhesjons komplekser til makromolekylære plattformer som formidler forskjellige spenningsavhengige signalbaner ^{4, 24.} Cellelyse etterfulgt av kule konsentrasjon ved anvendelse av en magnet tillater isolering av adhesjonsegenskapene plattformer. Andre metoder som brukes for å rense adhesjons komplekser har allerede blitt brukt i adherente celler. De kombinerer kjemisk kryssbinding for å spare protein-protein interaksjonerog en cellelyseringstrinn av vaskemiddel og skjærflyt eller ultralydbehandling ^{20, 21, 25, 26, 27, 28.} Det siste trinnet er samlingen av de resulterende ventrale plasmamembraner inneholdende de adhesjons komplekser. I motsetning til disse fremgangsmåter, magnetiske kuler tillate en høyere grad av rensing celle adhesjons komplekser ved selektivt rettet mot en bestemt familie av adhesjonsreseptorer. Magnetiske kuler har allerede blitt brukt for å rense adhesjons komplekser i ikke-adherente celler bundet til ligand-belagte mikrokuler ^{29, 30.} Metoden er beskrevet nedenfor ligner biologiske situasjoner der makt er søkt om en kort vedvarende periode (sekunder til minutter). Derfor gir det et kraftig verktøy for å undersøke både den molekylære sammensetningen av renset vedheft komplekser ognedstrøms mechanosensitive-signalveier.

Her presenterer vi en detaljert forsøksprotokoll for å bruke magnetiske kuler for å bruke strekkrefter til vedheft overflateproteiner. En permanent neodym-magnet er plassert på toppen av kulturskålen overflate. Den polflate av magneten er plassert ved en høyde på 6 mm, slik at kraften på et enkelt 2,8 pm magnetiske kuler er konstant (omkring 30 til 40 pn) ^31. Varigheten av spenning stimulering bestemmes av operatøren avhengig av molekyl av interesse og dens tidsskala for aktivering. Celler blir lysert endelig, adhesjons komplekser blir renset ved hjelp av kuler separasjon ved anvendelse av en magnet og biokjemiske analyser blir behandlet. Denne protokollen innbefatter fremstilling av ligand-belagt superparamagnetiske kuler, og det utøves strekk gjennom magnet etterfulgt av biokjemiske analyser. I tillegg tilbyr vi et representativt utvalg av data som viser at spenning påføres intebaserte adhesions induserer vedheft ombygging og endrer protein tyrosin fosforylering.

Protocol

1. Ligand Bøyning til magnetiske kuler Bemerk: Ligand konjugering utføres ved hjelp av superparamagnetiske tosyl-aktiverte kuler med en 2,8 um diameter (stamoppløsning konsentrasjon 10 8 perler / ml, 30 mg kuler / ml). Den følgende protokollen er basert på prøver av omtrent 2 x 10 5 celler, som tilsvarer MRC-5-celler dyrket til 80% konfluens i en 60 mm vevskulturskål. Juster volumet av perler og reagenser tilsvarende ved bruk plater av forskjellige størrelser elle…

Representative Results

Skjematisk av den teknikk som er illustrert i figur 1a. Etter ligand konjugasjon, er magnetiske kuler inkubert med cellene i 20 minutter, og deretter en permanent magnet anvendes for å påføre strekkrefter på omtrent 30-40 pN for forskjellige tidsrom. Figur 1b viser 2,8 um FN-belagte magnetiske kuler bundet til MRC5 celle-adhesjonsreseptorer. Vasketrinnet av superparamagnetiske kuler etter cellelyse er avgjørende, og bestemme graden av rensing. Et minimu…

Discussion

Metoden som er beskrevet her danner en grei måte å påføre spenning til celleoverflate adhesjonsreseptorer og tillate deres påfølgende rensing. Men noen trinn er kritisk for å utføre effektiv adhesjon rensing og eventuell optimering kan gjøres avhengig av den målrettede adhesjonsreseptorer. Vi presenterer potensielle problemer brukeren kan oppstå under.

Vi brukte 2,8 um diameter magnetiske kuler men større perler kan anvendes, slik som 4,5 um diameter. Imidlertid bør kulediameter…

Materials

Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	DX88-N52	grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	superparamagnetic beads
DynaMag-2 Magnet	Thermofisher	12321D
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	Fibronectin from bovine plasma
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1428-50MG	Bovine Apo-Transferrin
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate	Life Technologies	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60*15 mm culture dish	Falcon	353004