Culture of Adult transgene zebrafisk Retinal Eksplantater til Live-celle Imaging af multifoton Microscopy
Summary
Zebrafisk retinal regenerering er for det meste blevet undersøgt ved hjælp af faste nethinder. Imidlertid dynamiske processer såsom interkinetic nuklear migration forekomme under den regenerative respons og kræver live-cell imaging at undersøge de underliggende mekanismer. Her beskriver vi kultur og billedbehandling betingelser for at overvåge Interkinetic Nuclear Migration (INM) i realtid ved hjælp multifoton mikroskopi.
Abstract
Et endogene regenerering program er initieret af Müller glia i den voksne zebrafisk (Danio rerio) nethinden efter neuronal beskadigelse og død. Müller glia genindtræde i cellecyklus og producere neuronale stamceller, der undergår efterfølgende runder af celledelinger og differentiere til de tabte neuronale celletyper. Både Müller glia og neuronal progenitor cellekerner replikere deres DNA og undergår mitose i forskellige steder i nethinden, dvs. de vandrer mellem den basale Inner Nuclear Layer (INL) og den ydre kernelag (ONL) henholdsvis i en fremgangsmåde beskrevet som Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM er overvejende blevet undersøgt i udviklingslandene nethinden. For at undersøge dynamikken i INM i den voksne regenerere zebrafisk nethinden i detaljer, er live-cell imaging af fluorescensmærkede Müller glia / neuronale progenitorceller påkrævet. Her giver vi betingelserne for at isolere og kultur dorsale nethinderfra Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk, der blev udsat for konstant intense lys for 35 timer. Vi viser også, at disse retina kulturer er rentabelt at udføre levende celle billeddannelse eksperimenter, løbende erhverve z-stak billeder i hele tykkelsen af nethinden eksplantatet i op til 8 timer ved hjælp multifoton mikroskopi til at overvåge vandrende adfærd GFAP: nGFP -positive celler . Derudover beskriver vi detaljerne til at udføre post-imaging-analyse for at bestemme hastigheden af apikale og basale INM. For at opsummere, vi etableret betingelser for at studere dynamikken i INM i en voksen model af neuronal regenerering. Dette vil fremme vores forståelse af denne vigtige cellulære proces og give os mulighed for at bestemme de mekanismer, der styrer INM.
Introduction
I modsætning til mennesker, zebrafisk (Danio rerio) udviser en robust regenerering respons ved celledød af retinale neuroner 1, 2, 3, 4. Tumornekrosefaktor α, et signalmolekyle, der frigives fra døende retinale neuroner inducerer Müller glia bosiddende i den basale Inner Nuclear Layer (INL) af nethinden, at proliferere 5 og producere neuronale progenitorceller, der fortsat proliferere før differentiere til neuroncellen typer, der døde 2, 3, 4. Under den proliferative fase af regenereringen respons, kernerne i Müller glia og afledte neuronale progenitorceller undergår en gentagen trækmønster i fase med cellecyklussen (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 </sup > 7. Kerner placeret i den basale INL replikere deres DNA før overgangen til den ydre Nuclear Layer (ONL), hvor de deler før der opstår kerner tilbage basalt til INL. Denne fremgangsmåde blev først beskrevet under neuroepitel udvikling ved hjælp histologiske fremgangsmåder, mens live-cell billedteknik senere bekræftet fortolkningen af Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Både histokemiske og live-cell imaging fremgangsmåder er blevet anvendt til at bestemme mekanismerne bag INM og dens funktion i udviklingen neuroepithelia herunder nethinden 9, 11, 12, 13. Imidlertid har de mekanismer, der styrer INM i den voksne regenerere nethinden ikke undersøgt i mange detaljerxref "> 6, 7. live-cell imaging vil være en uvurderlig tilgang til fremme vores viden om de signalveje, der styrer INM i den voksne regenerere nethinden.
Indtil for nylig var live-cell imaging af INM i nethinden begrænset til enten levende zebrafisk embryoner eller embryonale kylling eller postnatal mus retinale eksplantater 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mens retinale eksplantater fra voksne dyr af forskellige arter, herunder mus, rotter og zebrafisk har været brugt i forskellige celle biologiske metoder 17, 18, 19, 20, live-celle eksperimenter imaging hjælp retinale eksplantater have blevet begrænset til korte perioder, og er ikke blevet gennemført kontinuerligt over flere timer 21, 22. Her beskriver vi en detaljeret protokol til kultur lys-beskadigede voksne zebrafisk nethinder at optræde live-cell imaging eksperimenter overvågning INM ved hjælp af multi-foton mikroskopi 6. Live-cell imaging tilgange er fordelagtige i forhold immunhistokemiske metoder, når undersøger de mekanismer, der styrer INM, da dynamikken i INM, fx hastigheder kan være påvirket i stedet for placeringen af mitose, hvilket ville potentielt ikke påvises ved anvendelse immuncytokemi.
I fremtiden, denne metode har også potentiale til at blive modificeret til at studere andre dynamiske processer i retinal regenerering, såsom fagocytose af døende fotoreceptorer af Müller glia eller adfærd mikroglia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Undersøgelser undersøger de mekanismer for regenerering af beskadigede voksne zebrafisk nethinden overvejende brugte immuncytokemiske metoder 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Etablering betingelser til kultur retinale eksplantater og til at udføre live-cell imaging på fænomener, såsom INM, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi sætter pris på den støtte, som William Archer og Notre Dame Integrated Imaging Facility. En særlig tak rettes til Freimann Life Sciences teknikere for deres fortsatte hjælp og deres pleje og opdræt af zebrafisk. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Eye Institute of NIH til DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) og Center for zebrafisk Research, University of Notre Dame, Notre Dame, IN.
Materials
| Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
- Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
- Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O’Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
- Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
- Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
- Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
- Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
- Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
- Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
- Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
- Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
- Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
- Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
- Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
- Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging–historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
- Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
- Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
- Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
- Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
- Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
- Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
- Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
- Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
- Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
- Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).
