该<em>离体</em>结肠器官培养及使用抗菌宿主防御研究
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
肠道显示由不同类型的上皮细胞，含有免疫细胞薄层propia，和基质的重复隐窝结构的架构。所有这些异构细胞有助于肠道内环境稳定，参与抗菌宿主防御。因此，确定了在体外环境研究免疫反应和肠的抗微生物活性的替代模型是极具挑战性。 体外研究使用永生化肠上皮细胞系或甚至小学隐窝化培养并不代表正常的肠道和微环境的确切生理学。在这里，我们在培养皿以及如何体外器官培养系统可以在与抗微生物宿主防御反应的研究来实现讨论培养小鼠结肠组织的方法。在代表的实验中，我们发现，在器官培养冒号表达RESP抗菌肽ONSE外源性的IL-1β和IL-18。此外，通过在器官培养的结肠组织中产生抗菌效应分子有效地杀灭体外大肠杆菌 。这种方法，因此，可以利用解剖在调节肠道先天免疫反应和抗微生物宿主防御反应的病原体和危险相关的分子模式和它们的细胞受体的作用。
Introduction
肠道代表充当共生微生物屏障的动态系统，地对抗入侵的病原体，并调节微生物组成1。肠上皮细胞，包括肠，杯状细胞，帕内特细胞和肠内分泌细胞，是主要的细胞群提供对抗肠道微生物的宿主防御反应。杯状细胞产生上创建上皮层2的顶部上的非军事区的粘蛋白。的帕内特细胞和肠上皮产生的抗微生物肽，细胞因子，和构成抗微生物宿主防御反应和有助于形成肠道微生物组合物3,4活性氧和氮物种。除了上皮细胞，免疫细胞，包括巨噬细胞，树突细胞，嗜中性粒细胞，自然杀伤细胞，淋巴细胞和茵 7 –固有层和粘膜下层德淋巴样细胞通过产生细胞因子，趋化因子和其他介质5发挥肠道抗菌宿主防御反应的关键作用。为了了解粘膜免疫系统如何监管和微生物提供了对微生物感染的保护，应考虑肠道的异质细胞群的复杂的相互作用是非常重要的。但是，包括所有的肠的功能的体外模型是不可用的。因此，在肠道内的宿主 – 病原体相互作用的分子研究是极具挑战性的。
在过去的几年中，模仿肠粘膜的各方面的几个模型系统已被开发用于研究参与炎症性肠疾病（IBD）和其它胃肠道病症8的病理生理过程–=“外部参照”> 14。永生化肠上皮细胞系通常用于研究上皮细胞特异性应答。然而，由于差异基因表达和永生化细胞的功能，从利用这些细胞不经常匹配与那些在体内研究观察到的获得的数据。肠隐窝化培养最近出现作为评估的肠上皮细胞对不同刺激13的反应的潜在工具。在这个系统中，隐窝干细胞被允许生长和发展三维类器官结构。而类器官培养系统是用于研究肠上皮的许多方面非常有用的，它不模仿免疫细胞，上皮细胞和微生物产品的复杂的相互作用。肠组织的体外培养提供体内宿主防御反应的一个更好的代表性。在该方法中，小肠的部分是在一个细胞培养板机智培养ħ适当的媒体，允许不同类型的肠细胞群是代谢活性为至少48小时。因此，器官的离体培养，可以用于测量抗微生物的基因的表达和肠道的特定刺激宿主防御反应。
调查人员一直在使用体外器官培养系统来研究肠道对15微生物感染的宿主防御反应– 21。我们最近通过了器官培养系统研究抗菌宿主防御反应的炎性体在小鼠结肠22的作用。炎性为胱天蛋白酶-1的激活，这是需要用于生产成熟的IL-1β和IL-18的分子的平台。我们发现，IL-1β和IL-18诱导的抗微生物肽，有效地杀死共生pathobionts诸如大肠杆菌 </em>。此观察与炎性缺陷小鼠结肠22增加大肠杆菌的负担是一致的。该系统因此可以被用来研究如炎性肠病（IBD）和结肠直肠癌（CRC）的模式识别受体（的PRRs）等天然免疫分子在肠道抗菌宿主防御反应肠道疾病中的作用，以及发病。有超过200的IBD易感性基因，突变在许多这些基因与在肠道中改变的微生物组合物相关联。这是重要的临床意义，以确定通过其IBD易感基因调节肠道菌群的确切机制。该方法的总体目标是引进体外结肠器官培养的基本协议并展示如何此培养方法可用于研究肠的抗微生物宿主防御反应。
Protocol
Representative Results
Discussion
肠上皮细胞在它们的生长方面的要求非常敏感，因此，难以培养。用EDTA处理分离的上皮细胞不以常规的细胞培养基如DMEM 8生存。因此，使用隔离隐窝或主要上皮细胞宿主 – 病原体相互作用的研究是非常具有挑战性的。最近，Sato等人。描述的地穴化培养系统，这是非常有前途的和有用的相关肠道病理生理学研究13。而组织体代表肠隐窝的许多特征，有人担心作为…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
癌症预防和得克萨斯州的研究所（CPRIT; RP160169）和德克萨斯大学西南医学中心给MHZ，这项工作是由来自克隆氏病和美国结肠炎基金会（CCFA 3711）资金支持
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
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