Det<em> Ex vivo</em> Colon Organ Kultur og dens anvendelse i Antimikrobiel Host Defense Studies
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
Tarmen viser en arkitektur af repetitive crypt strukturer bestående af forskellige typer af epitelceller, lamina propia indeholdende immunceller, og stroma. Alle disse heterogene celler bidrager til intestinal homeostase og deltage i antimikrobielt værtsforsvar. Derfor identificerer en surrogat model til undersøgelse immunrespons og antimikrobielle aktivitet af tarmen i et in vitro indstilling er ekstremt udfordrende. In vitro-studier ved hjælp udødeliggjort tarm epitelial cellelinjer eller endda primær krypt organoide kultur ikke repræsenterer den nøjagtige fysiologi normal tarmen og dens mikromiljø. Her diskuterer vi en fremgangsmåde til dyrkning muse colon væv i en dyrkningsskål og hvordan dette ex vivo organ dyrkningssystem kan implementeres i undersøgelser vedrørende antimikrobielle værtsforsvarsmekanismer responser. I repræsentative eksperimenter, viste vi, at koloner i orgel kultur udtrykker antimikrobielle peptider i hhvonse til exogent IL-1β og IL-18. Endvidere er de antimikrobielle effektormolekyler produceret af kolon væv i organkultur effektivt dræbe Escherichia coli in vitro. Denne fremgangsmåde kan derfor anvendes til at dissekere rolle pathogen- og fare-associeret molekylære mønstre og deres cellulære receptorer i reguleringen intestinale medfødte immunresponser og antimikrobielle værtsforsvarsmekanismer responser.
Introduction
Tarmen repræsenterer et dynamisk system, der virker som en barriere for kommensale mikroorganismer, kæmper mod invaderende patogener, og regulerer den mikrobielle sammensætning 1. De intestinale epitelceller, der består af enterocytter, slimceller, Paneth celler og enteroendocrine celler, er de store cellepopulationer, der giver værtsforsvarsceller responser mod intestinale mikroflora. De bægerceller producere muciner, der skaber en demilitariseret zone på toppen af epitel lag 2. De Paneth celler og enterocytter producerer antimikrobielle peptider, cytokiner og reaktive ilt og kvælstof arter, der udgør antimikrobielle vært forsvar svarene og bidrage til at forme den intestinale mikrobielle sammensætning 3, 4. Ud over epitelceller, immuncellerne herunder makrofager, dendritiske celler, neutrofiler, naturlige dræberceller, lymfocytter og inna te lymfoide celler i lamina propria og submucosa spiller en kritisk rolle i intestinale antimikrobielle værtsforsvarsmekanismer responser ved producerende cytokiner, kemokiner og andre mediatorer 5 – 7. For at forstå, hvordan det mucosale immunsystem regulerer mikroflora og yder beskyttelse mod mikrobiel infektion, er det vigtigt at overveje det komplekse samspil af de heterogene cellepopulationer i tarmen. Men en in vitro model, der omfatter alle trækkene i tarmen er ikke tilgængelig. Derfor molekylære undersøgelser af vært-patogen interaktion i tarmen er meget udfordrende.
I de seneste år har adskillige modelsystemer, der efterligner aspekter af tarmslimhinden blevet udviklet til undersøgelse af patofysiologiske processer involveret i inflammatoriske tarmsygdomme (IBD) og andre gastrointestinale lidelser 8 –= "xref"> 14. Immortaliserede intestinale epiteliale cellelinier anvendes ofte til at studere epithelial cellespecifikke responser. Men på grund af differentiel genekspression og funktion i immortaliserede celler, data opnået fra anvendelse af disse celler ikke matcher ofte med dem, der observeres i in vivo-undersøgelser. Intestinal krypt organoide kultur har for nylig vist sig som en potentiel værktøj til vurdering af svaret fra tarmepitelet til forskellige stimuli 13. I dette system er krypt stamceller lov til at vokse og udvikle en 3D organoide struktur. Mens det organoide dyrkningssystem er meget nyttigt til at studere mange aspekter af tarmepitelet, betyder det ikke efterligne det komplicerede samspil af immunceller, epitelceller og mikrobielle produkter. Ex vivo kultur af tarmvævet tilbyder en bedre repræsentation af in vivo værtsforsvarsmekanismer responser. Ved denne fremgangsmåde en del af tarmen dyrkes i en cellekultur plade with passende medier tillader de forskellige typer af cellepopulationer i tarmen til at være metabolisk aktive i mindst 48 timer. Således kan en ex vivo kultur af organet anvendes til at måle ekspressionen af antimikrobielle gener og værtsforsvarsceller responser i tarmen til en bestemt stimulus.
Forskere har været ved hjælp af ex vivo organkultur til undersøgelse værtsforsvarsceller reaktioner mod mikrobiel infektion i tarmen 15 -. 21 Vi har for nylig vedtaget orgel kultur-systemet til at studere rolle inflammasome i antimikrobielle vært forsvar reaktioner i muse koloner 22. Inflammasome er en molekylær platform for aktiveringen af caspase-1, som er nødvendig til produktion af modnet IL-1β og IL-18. Vi viste, at IL-1β og IL-18 inducerer antimikrobielle peptider som effektivt dræber kommensale pathobionts såsom E. coli </em>. Denne observation var i overensstemmelse med forhøjet E. coli byrde i Inflammasome-defekte mus koloner 22. Dette system kan derfor anvendes til at undersøge den rolle, mønstergenkendelse receptorer (PRRS) og andre medfødte immunmolekyler i intestinale antimikrobielle værtsforsvarsmekanismer responser samt patogenesen af intestinale lidelser, såsom inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og kolorektal cancer (CRC). Der er mere end 200 IBD modtagelighed gener og mutationer i mange af disse gener er associeret med ændret mikrobielle sammensætning i tarmen. Det er af stor klinisk betydning for at bestemme den præcise mekanisme, hvorigennem IBD-modtagelighed gener regulerer gut mikrobiota. Det overordnede mål med denne metode er at indføre en grundlæggende protokol af ex vivo colon organkultur og vise, hvordan denne kultur metode kan anvendes til at studere antimikrobielle værtsforsvarsmekanismer responser i tarmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De intestinale epitelceller er meget følsomme med hensyn til deres vækstkrav og derfor vanskelige at dyrke. Epitelcellerne isoleret ved EDTA-behandling ikke overlever i konventionelle celledyrkningsmedier såsom DMEM 8. Derfor værtspatogene interaktionsundersøgelser anvendelse af isolerede krypt eller primære epitelceller er meget udfordrende. For nylig, Sato et al. beskrev en krypt organoide kultur, som er meget lovende og nyttigt for undersøgelser i forbindelse med tarm patofysiologi <sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler fra Crohns og Colitis Foundation of America, (CCFA, 3711) Cancer Prevention og Research Institute of Texas (CPRIT, RP160169), og UT Southwestern Medical Center givet til MHZ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
References
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
