<em> पूर्व विवो</em> पेट के अंग संस्कृति और रोगाणुरोधी होस्ट रक्षा अध्ययन में इसके उपयोग
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
आंत दोहराए तहखाना उपकला कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार, पटल प्रतिरक्षा कोशिकाओं से युक्त Propia, और स्ट्रोमा से मिलकर संरचनाओं के एक वास्तुकला प्रदर्शित करता है। इन विषम कोशिकाओं के सभी आंतों homeostasis में योगदान और रोगाणुरोधी मेजबान बचाव में भाग लेते हैं। इसलिए, इन विट्रो सेटिंग में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और आंत के रोगाणुरोधी गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक किराए मॉडल की पहचान बेहद चुनौतीपूर्ण है। इन विट्रो अध्ययन में अमर आंतों उपकला सेल लाइनों या यहां तक कि प्राथमिक तहखाना organoid संस्कृति सामान्य आंत और इसके microenvironment की सटीक शरीर क्रिया विज्ञान का प्रतिनिधित्व नहीं करते इस्तेमाल करते हैं। यहाँ, हम एक संस्कृति डिश और कैसे इस पूर्व vivo अंग संस्कृति प्रणाली रोगाणुरोधी मेजबान बचाव प्रतिक्रियाओं से संबंधित अध्ययन में लागू किया जा सकता है में संवर्धन माउस पेट के ऊतकों की एक विधि पर चर्चा की। प्रतिनिधि प्रयोगों में, हम पता चला है कि अंग संस्कृति में कॉलन resp में रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स का इजहारबहिर्जात आईएल 1β और आईएल -18 को Onse। इसके अलावा, रोगाणुरोधी प्रेरक अंग संस्कृति में पेट के ऊतकों द्वारा उत्पादित अणुओं कुशलता से इन विट्रो में कोलाई को मारने। यह दृष्टिकोण, इसलिए, आंतों सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और रोगाणुरोधी मेजबान बचाव प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में pathogen- और खतरे से जुड़े आणविक पैटर्न और उनके सेलुलर रिसेप्टर्स की भूमिका काटना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
आंत, एक गतिशील प्रणाली है कि खानेवाला सूक्ष्मजीवों के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है का प्रतिनिधित्व करता हमलावर रोगजनकों के खिलाफ लड़ता है, और माइक्रोबियल रचना 1 नियंत्रित करता है। आंतों उपकला कोशिकाओं, एन्तेरोच्य्तेस, जाम कोशिकाओं, Paneth कोशिकाओं और enteroendocrine कोशिकाओं से मिलकर, प्रमुख सेल आबादी है कि आंतों माइक्रोबायोटा के खिलाफ मेजबान बचाव प्रतिक्रियाओं प्रदान कर रहे हैं। जाम कोशिकाओं mucins कि उपकला परत 2 के शीर्ष पर एक ग़ैरफ़ौजीकरण जोन बनाने का उत्पादन। Paneth कोशिकाओं और एन्तेरोच्य्तेस रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स, साइटोकिन्स, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजाति है कि रोगाणुरोधी मेजबान बचाव प्रतिक्रियाओं का गठन और आंत्र माइक्रोबियल रचना 3, 4 को आकार देने के लिए योगदान का उत्पादन। उपकला कोशिकाओं के अलावा, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, लिम्फोसाइटों, और इन्ना सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं 7 – लामिना propria और submucosa में ते लसीकावत् कोशिकाओं के उत्पादन साइटोकिन्स, Chemokines, और अन्य मध्यस्थों 5 से आंतों रोगाणुरोधी मेजबान बचाव प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। आदेश में समझने के लिए कैसे श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रणाली को नियंत्रित करता है और माइक्रोबायोटा सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करता है, यह पेट की विषम सेल आबादी के जटिल बातचीत पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, इन विट्रो मॉडल है कि आंत की सुविधाओं के सभी शामिल हैं उपलब्ध नहीं है। इसलिए, आंत में मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पर आणविक पढ़ाई के अत्यधिक चुनौतीपूर्ण हैं।
पिछले कुछ वर्षों में, कई मॉडल प्रणाली है कि आंत्र mucosa के पहलुओं की नकल pathophysiological सूजन आंत्र रोग (IBD) और अन्य गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों 8 में शामिल प्रक्रियाओं की जांच के लिए विकसित किया गया है –= "xref"> 14। अमर आंतों उपकला सेल लाइनों अक्सर उपकला सेल विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि, अंतर जीन अभिव्यक्ति और अमर कोशिकाओं में समारोह की वजह से, डेटा उन कोशिकाओं का उपयोग अक्सर vivo अध्ययन में मनाया उन लोगों के साथ मेल नहीं खाते से प्राप्त की। आंतों तहखाना organoid संस्कृति हाल ही में विभिन्न उत्तेजनाओं से 13 आंत्र उपकला की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक संभावित उपकरण के रूप में उभरा है। इस प्रणाली में, तहखाना स्टेम कोशिकाओं के विकास और एक 3 डी organoid संरचना विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है। जबकि organoid संस्कृति प्रणाली आंतों उपकला के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है, यह प्रतिरक्षा कोशिकाओं, उपकला कोशिकाओं और सूक्ष्म उत्पादों की जटिल बातचीत की नकल नहीं है। आंतों के ऊतकों के पूर्व vivo संस्कृति में विवो मेजबान बचाव प्रतिक्रियाओं का एक बेहतर प्रतिनिधित्व प्रदान करता है। इस विधि में, आंत का एक हिस्सा एक सेल कल्चर प्लेट बुद्धि में सुसंस्कृत हैज उपयुक्त मीडिया आंत में सेल आबादी के विभिन्न प्रकार की अनुमति के लिए कम से कम 48 घंटे के लिए पाचन सक्रिय होने के लिए। इस प्रकार, एक पूर्व vivo अंग की संस्कृति रोगाणुरोधी जीनों की अभिव्यक्ति है और एक विशेष प्रोत्साहन के लिए आंत के मेजबान बचाव प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
21 – जांचकर्ता आंत 15 में सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण के खिलाफ मेजबान बचाव प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पूर्व vivo अंग संस्कृति प्रणाली का उपयोग किया गया है। हमने हाल ही में माउस कॉलन 22 में रोगाणुरोधी मेजबान बचाव प्रतिक्रिया में inflammasome की भूमिका का अध्ययन करने के लिए अंग संस्कृति प्रणाली को अपनाया। inflammasome कस्पासे 1 की सक्रियता, जो परिपक्व आईएल 1β और आईएल -18 के उत्पादन के लिए आवश्यक है के लिए एक आणविक मंच है। हम पता चला कि आईएल 1β और आईएल 18 रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स इस तरह के ई कोलाई के रूप में है जो प्रभावी खानेवाला pathobionts को मारने के लिए प्रेरित </em>। इस अवलोकन inflammasome-दोषपूर्ण माउस कॉलन 22 में वृद्धि हुई ई कोलाई बोझ के अनुरूप था। इस प्रणाली इसलिए इस तरह के भड़काऊ आंत्र रोग (IBD) और कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) के रूप में पेट के रोगों की आंतों रोगाणुरोधी मेजबान बचाव प्रतिक्रिया में पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRS) और अन्य सहज प्रतिरक्षा अणुओं की भूमिका के रूप में अच्छी तरह से रोगजनन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वहाँ 200 से अधिक आईबीडी संवेदनशीलता जीन, और इन जीनों में से कई के पेट में बदल माइक्रोबियल रचना के साथ जुड़े रहे हैं में परिवर्तन कर रहे हैं। यह सटीक व्यवस्था है जिसके माध्यम से आईबीडी-संवेदनशीलता जीन पेट microbiota विनियमित निर्धारित करने के लिए महान नैदानिक महत्व का है। इस विधि के समग्र लक्ष्य के पूर्व vivo पेट के अंग संस्कृति की एक बुनियादी प्रोटोकॉल को लागू करने और प्रदर्शन कैसे इस संस्कृति विधि आंत के रोगाणुरोधी मेजबान बचाव प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आंतों उपकला कोशिकाओं उनके विकास की आवश्यकताओं के मामले में बहुत संवेदनशील है और इसलिए संस्कृति के लिए मुश्किल हो जाता है। उपकला EDTA उपचार से अलग कक्षों में इस तरह के DMEM 8 के रूप में पारंपरिक सेल स…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कैंसर की रोकथाम और टेक्सास के अनुसंधान संस्थान (CPRIT; RP160169), और केन्द्र शासित प्रदेशों के दक्षिण मेडिकल सेंटर मेगाहर्ट्ज के लिए दिया जाता है, यह काम क्रोहन और अमेरिका के कोलाइटिस फाउंडेशन, (3711 CCFA) से धन के द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
References
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
