本文介绍了止血的实验模型,同时测量血小板功能和凝血。血小板和纤维蛋白的荧光实时测量,并且血小板附着率,凝固速度,和凝血的发病被确定。该模型被用于确定下在浓缩物用于输血流动血小板促凝性能。
止血的微流体模型评估流体剪切的条件下,血小板的功能,但在抗凝血剂的存在下,该分析被限制为仅血小板沉积。钙离子依赖凝血和血小板功能之间的错综复杂的关系,需要分析前的血液细心和控制再钙化。我们设置使用一个Y形的混合通道,它提供集中的钙 /镁离子缓冲刚刚灌注前的血液流动,从而实现快速复钙样品无瘀。两者之间的水库流量速度的10倍的差距最小的稀释。该复钙血液然后在胶原包被的分析腔室的灌注,和差异化标记允许使用荧光视频显微镜既血小板和纤维蛋白沉积的实时成像。该系统只使用可商购的工具,增加标准化的机率。救援人员到场的重建mbocytopenic血液与血小板篇章集中。此外机型血小板输注,证明了其在这一研究领域的使用。示例性数据表明,凝固起始和纤维蛋白沉积为线性依赖于血小板浓度,证实在我们的模型中原发性和继发止血之间的关系。在16分钟灌注的时限,接触激活未能成行,尽管钙化正常的Ca 2+和镁离子水平。当凝血凝血因子XIIa用玉米胰蛋白酶抑制剂抑制,这一时间范围甚至更长的时间,指示其中在血小板促凝性质的变化可以评估相当动态范围。胶原组织因子的共固定化显著减少到发病凝血的时间,而不是它的速率。研究组织因子和/或接触的途径中的选项增加该测定的通用性和实用性。
小学和中学止血最初概念化为两个比较可分离的生化过程。初级止血被视为在动脉流动条件的一个主要因素,与血小板关键作用,而次级止血被视为支配下静脉血流凝固,使蛋白酶级联以形成不溶性纤维蛋白。在过去的几十年里大幅重塑这一传统观点,承认血小板活化和凝血相互依存,在所有(非极端)流体力学让人误解的生理和病理过程中止血同样重要的过程。这一观点已被翻译到诊所,制定全面衡量全血凝血试验正越来越多地使用,尽管在相关性,应用性和实用性1许多剩余的问题。
我们最近发表的血小板的功能分析集中使用在输血2的体外模型涂覆有纤维状胶原微流体流动室,用含有红细胞,血浆和血小板的正常量的样品。此方法使用肝素或水蛭素抗凝固处理的血液,这意味着没有或仲止血,这是依赖于凝血酶生成和离子化钙(Ca 2+)的有限的参与。为了支持凝血酶形成,从而包括在微流止血的方方面面,我们在同一技术平台上开发的补充方法,包括现在游离钙离子 。以这种方式,血小板沉积和纤维蛋白形成,可以研究,再次在血小板输注的模型,以评估血小板浓缩质量。
在该方法中,血小板和纤维蛋白原标记与已完全分离的发射光谱的荧光团。双色,实时视频显微镜然后允许的分析初级血小板粘附,以及凝固起始和纤维蛋白沉积。在这种类型的测定法的一个重要的变量是再钙化,由于添加Ca 2+的静态血液之前,灌注,势必造成在容器接触启动凝血。这将引发偏读出因灌注前的油管和生物芯片入口堵塞。因此,在我们的方法中,柠檬酸盐抗凝的血液和钙离子含缓冲通过一个Y形入口室的上腿分别泵送。各组分进入涂覆有单独的或与重组人组织因子(rhTF)组合胶原分析腔室之前灌注过程中混入。通过调整独立的泵的流速和Ca 2+的浓度的缓冲液中,最终血液样品的10%的稀释度进行。
使用这种扩展协议,我们展示凝块的贡献化因子XII(FXII)和血小板浓度接触下流动途径凝血启动。我们的数据还表明,通过涂布rhTF沿着胶原,组织因子途径可以伴随测量。
血小板输血是浓缩规定对血小板的患者,以防止或止血。其临床的影响最近强调了急性白血病12的历史回顾,回顾,增加儿科患者在六七十年代的生存率分别为主要归因于(血小板)输血医学的改进。血小板浓缩物也用于阻止在急性创伤或外科手术过程中止血。在这些条件下,片晶具有优良的促凝血场所迅速引发止血是优选的,但血小板浓缩物从自愿捐献者捐献制备,不像药理药物,是由制备标准化只,不通过(化学)组成。因此,在血库领域的几个问题是没有答案,包括那些捐赠的最佳方式,储存条件和输血的做法。在复数的领域atelet(输血)生物学,从循环细胞清除了很多问题,输注血小板的贡献止血,或它们的免疫学也仍然没有答案。
血小板功能分析众多的实验室技术是可用的,但这些大多涉及血小板功能的一个单一的方面,如聚集或脱粒13。要广泛评估血小板和浓缩血小板,止血全面的模型是必不可少的,而这些必须包括流体力学。血液流变是关键的止血14,15或血栓形成16中正确地解释血小板的行为,即使抗凝防止钙和/或凝血酶参与柠檬酸盐或肝素,分别为2的存在。研究凝血和血小板功能之间的相互影响下的流17,18,正常凝血酶生成是必需的,因此,游离Ca 2+为好。在这些条件下学习止血实验装置是复杂的,因为措施,以防止“伪”或凝固的不受控制的活化应采取尽可能。此外,许多专门的研究小组使用定制的硬件19,20,这会导致大量的实验室间的变异5。这种方法的典型局限性是使用矩形容器,非脉动流型材,和非人类表面涂层5。我们在这里描述的测定使用市售的工具,因此可适合用于标准化。
因为一旦血液不人体内包含凝血级联反应是很容易被激活,控制复钙是一个关键的步骤。 ŧõ达到这个目的,添加Ca 2+需要被推迟到刚刚灌注在活性胶原表面之前,因为当大量静态血液被供给的 Ca 2+缓冲,凝血难免发生,最终堵塞管路和偏置数据解释(数据未显示)。对这个问题的解决是分别泵送的 Ca 2+缓冲液和血液中,从而允许它的方式来分析室灌注期间通过对流和扩散力混合。完全混合是在混合和分析室之间管道的46厘米的段来实现的。这个长度是为试剂的最佳停留时间计算来混合基于在使用的流量灌注过程中的质量和对流运输21的基本法则(1000秒-1)。这种方法被证明可控性和可重复性。
凝血联系激活有时被视为简单的一件神器解释凝固时间时要避免血液取样和。因此,我们证明,在不存在抑制剂的,接触引起的凝固开始于灌注16.7分钟(±3.7分钟)。在CTI的存在下抑制FXIIa介导的接触活化,凝血未在任意限定的实验(30分钟)的过程中开始。实验的该窗口足够长,以辨别是亲或抗血栓形成的样品。尽管凝血通过接触激活可以是血液接触人工表面不想要的结果,我们的数据表明血小板明显的生物剂量效应。这对于输血医学重要的,因为最近的调查结果FXII,血小板聚磷酸盐10,磷脂酰丝氨酸分布22和血小板微粒23实际上重估接触途径凝血作为一个重要的贡献者,止血,E特别是在血栓形成24的情况下。例如,血小板输注患者变量产量或库存的血小板的变量磷脂酰丝氨酸表达可能从而诱发变异的疗效,如果显示成功凝血取决于这些因素。
通过共固定脂化rhTF与胶原蛋白,外源性凝血途径或TF途径中,对胶原血小板沉积期间激活。这扩展了检测,以最全面的方式,为带来血液与TF的细胞和组织接触受伤的典范。我们的数据显示,胶原和TF的共固定化降低凝血发病的时刻,但不改变凝结的速率。值得注意的是,rhTF的固定化在表面上的量在该模型25,26的一个重要变量,应该给定的研究中被标准化。在presenCTI的CE,所述TF途径可以专门研究(未示出),因为可以防止接触活化。
总之,我们的实验装置结合了血小板的血液血小板存入银行重组和钙依赖的血小板沉积和纤维蛋白形成在流体动力学流止血模型输血的典范。此测定法将被用来回答关于编组血小板促凝性质问题,并影响血小板浓缩物制备技术对本。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由基金会研究和比利时红十字会龙龙血液服务的发展提供支持。我们承认“Bijzonder onderzoeksfond”(BOF – 专项科研基金)提供的财政支持来自根特大学授予合同号BOF30290744项目。
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |