בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס
Summary
אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.
Abstract
למרות היתרונות של תחולה קלה ויעילות עלות, מודלים עכברי תת עוריים יש מגבלות חמורות לא מדויק המדמה גידול ביולוגיה גידול תאים סרטניים. מודלים עכבר Orthotopic כבר הציג להתגבר על מגבלות אלה; עם זאת, מודלים אלה הם תובעניים מבחינה טכנית, במיוחד איברים חלולים כגון המעיים הגדולים. כדי לייצר גידולים אחידים אשר לגדול באופן אמין גרורות, טכניקות סטנדרטיות של הכנת תאים סרטניים הזרקה הם קריטיים.
פיתחנו מודל עכבר אורטוטופי של סרטן המעי הגס (CRC), אשר מפתחת גידולים אחידים מאוד וניתן להשתמש בו ללימודי ביולוגיה של הגידול, כמו גם ניסויים טיפוליים. תאים סרטניים משני גידולים ראשוניים, תאים דו מימדיים (2D) או תאים תלת מימדיים (3D) מוזרקים לתוך cecum, בהתאם לפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים מוזרקים, יוצרים גידולים גרורתיים מאוד. בנוסף,CTCs ניתן למצוא באופן קבוע. אנו מתארים כאן את הטכניקה של הכנת תאים סרטניים משני שורות תאים דו-ממדיים ואורגנואידים תלת-ממדיים, כמו גם ברקמת הגידול הראשית, טכניקות ההזרקה וההזרקה, כמו גם בידוד של CTCs מן העכברים הנושאים גידולים, ומציעים עצות לפתרון בעיות.
Introduction
סרטן המעי הגס (CRC) הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר למוות סרטן במדינות מערביות. 1 בעוד הגידול הראשוני יכול לעיתים קרובות להיות resected, את התרחשות גרורות רחוקות באופן דרמטי מחריף את הפרוגנוזה ולעתים קרובות מוביל למוות. 2 , 3 מתאם ביולוגי של גרורות הוא מחזורי תאים סרטניים, אשר לנתק מן הגידול, לשרוד במחזור, לצרף את אפיתל באיבר היעד, לפלוש לאיבר ובסופו של דבר להתגבר על נגעים חדשים. 4 למרות שמדובר בחומר CTC ידוע בעל רלוונטיות פרוגנוסטית, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 הביולוגיה שלהם מובנת חלקית רק כתוצאה מן הנדירות הקיצונית שלהם ב- CRC. 10
מודלים עכבר הם לא חזקOol ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של סרטן. מודלים קלאסיים, תת עוריים מיוצרים על ידי הזרקה תת עורית של תאים סרטניים לעכברים הנמענים, אשר יכול להיות גם immunocompetent (אם תאים סרטניים Murine syngeneic משמשים) או immunodeficient. מודלים גידול תת-עוריים הם זולים ומייצרים נתונים במהירות; צמיחת הגידול של נקודת הסיום שלהם יכולה להיות נמדדת בקלות ובלא פולשניות. עם זאת, 88% של תרכובות חדשות שהפגינו פעילות אנטי-סרטנית במודלים כאלה נכשלות בניסויים קליניים. 11 זה בחלקו בשל הבדלים בין בני-אדם בין עכברים לעכברים; עם זאת, חלק גדול של כישלון זה נובע ערך מנבא נמוך של מודלים עכבר תת עורית.
מודלים עכבר Orthotopic, שבו תאים סרטניים מוזרקים לתוך איבר המוצא ובכך לגדול microenvironment המקורי שלהם, ולכן משמשים יותר ויותר במחקר סרטן. 11 , 12 , </sלמעלה> 13 , 14 מודלים אורתופטיים לא רק לדמות את התנאים גידול הגידול המקומי; כתוצאה מהאתר האנטומי של גידול הגידול, מודלים של עכבר אורטוטופיים מאפשרים גם סימולציה מציאותית של גרורות, ולכן הם משתמשים כדי לחקור את הביולוגיה של CTC 8 , 15 , 16 או את תגובתם לטיפולים שונים ב- CRC. 13 , 17
החיסרון העיקרי של מודלים עכבר אורתוטופיים היא המורכבות הטכנית שלהם. בהתאם האיבר שבו תאים להיות מוזרק, עקומת למידה עד הנסיין הוא מסוגל לגדל גידולים לשחזור הוא ארוך למדי. זה במיוחד חל על מודלים של סרטן המעי הגס, כמו תאים סרטניים צריך להיות מוזרק לתוך דופן המעיים, אשר לעתים קרובות התוצאות ניקוב, דליפת תא הגידול או הפסד endoluminal תא הגידול. זהRticle מיועד לתאר את השיטה של הכנת תאים דגימות רקמה ראשונית, שורות תאים 2D ותרבות אורגנואידית 3D הזרקתם לתוך cecum של עכברים. הטכניקה המתוארת כאן מוביל לגידולים אחידים מאוד, בהתאם לביולוגיה הגידול של קו התא המשמש להזרקת, היווצרות של גרורות מרוחקות ו CTCs בעכברים הנמען. 15
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות הפעילות המוכחת שלהם במודלים עכבריים תת-עוריים, הרוב הגדול של המרכיבים החדשים נכשל בניסויים קליניים ומעולם לא הגיע למרפאה. 11 זה חוסר ברור של מודלים עכבר תת עוריים כדי לדמות במדויק את הביולוגיה ואת דפוסי הצמיחה של גידולים הובילה לפיתוח מודלים עכבר or…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (WE 3548 / 4-1) ו- Roland-Ernst-Stiftung for Gesundheitswesen (1/14).
Materials
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine | Temgesic | – | |
| Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
- Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
- Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?. Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
- Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
- Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201 (2015).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82 (2013).
- Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
- Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
- Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
- Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107 (2014).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
- Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
- Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).
