Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto
Summary
Descriviamo la creazione di tumori colorettali ortotopici attraverso l'iniezione di cellule tumorali o organoidi nel cecum dei topi e il successivo isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da questo modello.
Abstract
Nonostante i vantaggi di una facile applicabilità e di un rapporto costo-efficacia, i modelli del topo sottocutaneo presentano gravi limitazioni e non simulano accuratamente la biologia tumorale e la diffusione delle cellule tumorali. I modelli di topo ortotopico sono stati introdotti per superare queste limitazioni; Tuttavia, tali modelli sono tecnicamente impegnativi, specialmente negli organi cavi come il grande intestino. Al fine di produrre tumori uniformi che crescono e metastasiano in modo affidabile, le tecniche standardizzate per la preparazione e l'iniezione delle cellule tumorali sono critiche.
Abbiamo sviluppato un modello di topo orthotopico del cancro del colon-retto (CRC) che sviluppa tumori altamente uniformi e può essere utilizzato per studi di biologia tumorale e studi terapeutici. Le cellule tumorali da tumori primari, linee cellulari 2D (2D) o organoidi tridimensionali (3D) vengono iniettati nel cecum e, a seconda del potenziale metastatico delle cellule tumorali iniettate, formano tumori altamente metastatici. Inoltre,I CTC possono essere trovati regolarmente. Qui descriviamo la tecnica della preparazione delle cellule tumorali da entrambe le linee cellulari 2D e dagli organoidi 3D, nonché dal tessuto tumorale primario, le tecniche chirurgiche e di iniezione, nonché l'isolamento di CTC dai topi tumorali e suggerimenti per la risoluzione dei problemi.
Introduction
Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle cause più comuni della morte del cancro nei paesi occidentali. 1 Mentre il tumore primario può spesso essere ripreso, il verificarsi di metastasi distanti peggiora drasticamente la prognosi e spesso porta alla morte. 2 , 3 Il correlato biologico della metastasi è la circolazione delle cellule tumorali (CTC), che si staccano dal tumore, sopravvivono in circolazione, si attaccano all'epitelio nell'organo bersaglio, invadono l'organo e, in ultima analisi, superano le nuove lesioni. 4 Anche se i CTC sono noti per essere di rilevanza prognostica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 la loro biologia è solo in parte capita a causa della loro estrema rarità nel CRC. 10
I modelli del mouse sono un potente tOol per studiare vari aspetti della biologia del cancro. I modelli classici tumorali sottocutanei vengono prodotti mediante iniezione sottocutanea di cellule tumorali in topi riceventi, che possono essere immunocompetenti (se vengono utilizzate cellule tumorali murine singeniche) o immunodeficienti. I modelli tumorali sottocutanei sono poco costosi e producono dati veloci; La loro crescita del tumore a punto finale può essere facilmente misurata e non invasiva. Tuttavia, l'88% dei nuovi composti che hanno dimostrato un'attività antitumorale in tali modelli non riescono a studi clinici. 11 Ciò è in parte dovuto alle differenze tra le specie umane e topi; Tuttavia, gran parte di questo fallimento è dovuto al basso valore predittivo dei modelli del topo sottocutaneo.
I modelli di topo ortotopico, in cui le cellule tumorali vengono iniettate nell'organo d'origine e quindi crescono nel loro microambiente originale, sono quindi sempre più utilizzate nella ricerca sul cancro. 11 , 12 , </sUp> 13 , 14 I modelli ortotopici non solo simulano le condizioni di crescita tumorale locale; Come risultato del sito anatomicamente corretto della crescita tumorale, i modelli ortotopici del mouse permettono anche una simulazione realistica di metastasi e sono quindi utilizzati per studiare la biologia CTC 8 , 15 , 16 o la loro risposta a diversi trattamenti in CRC. 13 , 17
Uno svantaggio maggiore dei modelli di topi ortotopici è la loro complessità tecnica. A seconda dell'organo in cui le cellule devono essere iniettate, la curva di apprendimento finché lo sperimentatore non è in grado di indurre tumori riproducibili è piuttosto lunga. Ciò vale in particolare per i modelli del cancro del colon-retto, in quanto le cellule tumorali devono essere iniettate nella parete intestinale, che spesso provoca perforazioni, perdite di cellule tumorali o perdita cellulare tumorale endoluminale. Questo unL'obiettivo è quello di descrivere il metodo di preparazione cellulare dai campioni di tessuto primario, dalle linee cellulari 2D e dalla cultura organoidea 3D e dalla loro iniezione nel cecum dei topi. La tecnica qui descritta porta a tumori altamente uniformi e, a seconda della biologia tumorale della linea cellulare utilizzata per l'iniezione, la riproducibile formazione di metastasi distinte e CTC nei topi riceventi. 15
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante la loro attività preclinica dimostrata nei modelli del topo sottocutaneo, la grande maggioranza dei nuovi composti non riesca a sperimentare cliniche e non raggiunge mai la clinica. 11 Questa evidente insufficienza dei modelli del topo sottocutaneo per simulare accuratamente i modelli di biologia e crescita dei tumori ha portato allo sviluppo di modelli ortotopici a base di iniezione di cellule tumorali direttamente nell'organo originale.
I modelli di …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla fondazione della ricerca tedesca (WE 3548 / 4-1) e Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).
Materials
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine | Temgesic | – | |
| Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
References
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