結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離
Summary
本発明者らは、腫瘍細胞またはオルガノイドをマウスの盲腸に注入することによる同所性結腸直腸腫瘍の確立およびこのモデルからの循環腫瘍細胞（CTC）のその後の単離について記載する。
Abstract
容易な適用性および費用対効果の利点にもかかわらず、皮下マウスモデルには重大な制限があり、腫瘍生物学および腫瘍細胞の播種を正確にシミュレートしない。これらの限界を克服するために、正三角形のマウスモデルが導入されている。しかしながら、そのようなモデルは、特に大腸のような中空器官において、技術的に要求されている。確実に増殖し転移する均一な腫瘍を作製するためには、腫瘍細胞の調製および注射の標準化技術が不可欠である。
我々は、非常に均一な腫瘍を発達させ、腫瘍の生物学的研究および治療的試験に使用できる結腸直腸癌（CR）の同所性マウスモデルを開発した。原発腫瘍、二次元（2D）細胞系または三次元（3D）オルガノイドのいずれかからの腫瘍細胞が盲腸内に注入され、注入された腫瘍細胞の転移能に応じて、高度に転移性の腫瘍を形成する。加えて、CTCsは定期的に見つけることができます。ここでは、2D細胞株および3Dオルガノイドならびに原発腫瘍組織、腫瘍移植マウスからの外科および注入技術ならびにCTCの単離ならびにトラブルシューティングのためのヒントを提供する。
Introduction
結腸直腸癌（CRC）は、西欧諸国における癌の死の最も一般的な原因の1つである。 1原発腫瘍はしばしば切除することができるが、遠隔転移の発生は劇的に予後を悪化させ、しばしば死に至る。腫瘍から切り離し2、3転移の生物学的相関循環している腫瘍細胞（CTCのは）、、、標的臓器に上皮に取り付け、循環の中で生き残る臓器に侵入し、最終的に新たな病変への脱却します。 4のCTCが予後関連性、5、6、7、8であることが知られているが、それらの生物学9は、部分的にのみCRCにおけるそれらの極端な希少性の結果として理解されます。 10
マウスモデルは強力なtです癌生物学のさまざまな側面を研究する古典的な皮下腫瘍モデルは、免疫担当者（同系マウス腫瘍細胞が使用される場合）または免疫不全のいずれかであり得るレシピエントマウスへの腫瘍細胞の皮下注射によって産生される。皮下腫瘍モデルは安価であり、データを迅速に生成する。それらのエンドポイント腫瘍増殖は容易かつ非侵襲的に測定することができる。しかしながら、そのようなモデルにおいて抗腫瘍活性を示した新規化合物の88％が臨床試験に失敗している。 11これは人間とマウスの種間の違いに一部原因があります。しかし、この失敗の大部分は皮下マウスモデルの予測値が低いためです。
したがって、腫瘍細胞が起源の器官に注入され、したがって元の微小環境で増殖する正所性のマウスモデルは、がん研究においてますます使用されている。 図11 、図 12 、 </sアップ> 13、14の同所モデルは、局所的な腫瘍の成長条件をシミュレートしないだけでなく、腫瘍増殖の解剖学的に正しいサイトの結果として、同所マウスモデルはまた、転移の現実的なシミュレーションを可能にし、したがって、CTCの生物学8、15、16またはCRCの異なる治療への応答を研究するために使用されています。 13、17
同所性マウスモデルの主な欠点は、その技術的な複雑さです。細胞が注入される臓器に応じて、実験者が再現性のある腫瘍を誘導するまでの学習曲線はかなり長い。これは、腫瘍細胞を腸壁に注入する必要があるため、結腸直腸癌モデルに特に適用され、穿孔、腫瘍細胞漏出、または腔内腫瘍細胞の損失をもたらすことが多い。これは、原型組織サンプル、2D細胞株および3Dオルガノイド培養からの細胞調製方法およびマウスの盲腸へのそれらの注入を記載することを意図している。ここに記載されている技術は、高度に均一な腫瘍をもたらし、そして注射に使用される細胞系の腫瘍生物学に応じて、レシピエントマウスにおける遠隔転移およびCTCの再現性のある形成をもたらす。 15
Protocol
ここに提示された動物実験は、機関および政府の動物保護および使用委員会によって独立して審査され、許可され、 実験動物連合連盟 （FELASA）のガイドラインに従って実施された。すべての可能な措置は、麻酔および鎮痛、または必要な場合には早期安楽死を含む苦痛を最小限にするためにとられた。 1.細胞およびオルガノイドの調製注：1回…
Representative Results
このモデルにおける結腸直腸腫瘍の成功し、再現性のある世代は、漏出または漏出のない細胞の正確な注入に決定的に依存する。これが達成されれば、このモデルは非常に信頼性が高く、人工腹膜播種の結果は非常にまれです。腫瘍の成長動力学ならびにそれらの拡散様式は、使用されるオルガノイドおよび細胞の生物学に依存する。 15 HCT116細胞は…
Discussion
皮下マウスモデルでのその前臨床的に証明された活性にもかかわらず、新規化合物の大部分は臨床試験に失敗し、決して診療所に到達しない。 11皮下マウスモデルのこの明らかな不足を正確に腫瘍の生物学および増殖パターンは、直接元の臓器への腫瘍細胞の注射に基づく同所性マウスモデルの開発につながっているシミュレートします。
オルソトー?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ドイツの研究財団（WE 3548 / 4-1）とローランド・エルンスト・シュタップゥン・ファール・ジェシードハイツェン（Roland-Ernst-StiftungfürGesundheitswesen）（1/14）によって支持された。
Materials
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine | Temgesic | – | |
| Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
References
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Citer Cet Article
Kochall, S., Thepkaysone, M., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).