Мы описываем установление ортотопических колоректальных опухолей путем инъекции опухолевых клеток или органоидов в слепую кишку мышей и последующее выделение циркулирующих опухолевых клеток (CTC) из этой модели.
Несмотря на преимущества легкой применимости и экономической эффективности, подкожные мышиные модели имеют серьезные ограничения и не точно имитируют биологию опухоли и распространение опухолевых клеток. Для преодоления этих ограничений были введены модели ортотопической мыши; Однако такие модели технически требуются, особенно в полых органах, таких как толстая кишка. Для получения однородных опухолей, которые надежно растут и метастазируются, стандартизированы методы подготовки и инъекции опухолевых клеток.
Мы разработали ортотопическую модель мышиного колоректального рака (CRC), которая развивает сильно однородные опухоли и может быть использована для исследований опухолевой биологии, а также для терапевтических испытаний. Опухолевые клетки из первичных опухолей, двумерных (2D) клеточных линий или трехмерных (3D) органоидов вводятся в слепую кишку и, в зависимости от метастатического потенциала инъецированных опухолевых клеток, образуют высокометастатические опухоли. К тому же,КТК можно найти регулярно. Здесь мы описываем методику получения опухолевых клеток как с 2D клеточными линиями, так и с 3D-органоидами, а также с первичной опухолевой тканью, хирургическими и инъекционными методами, а также с отделением CTC от опухолевых мышей и представляем советы по устранению неполадок.
Колоректальный рак (CRC) является одной из наиболее распространенных причин смерти от рака в западных странах. 1 В то время как первичная опухоль может часто быть иссекают, возникновение отдаленных метастазов значительно ухудшает прогноз и часто приводит к смерти. 2 , 3. Биологический коррелятор метастаза – это циркулирующие опухолевые клетки (CTC), которые отделяются от опухоли, выживают в обращении, прикрепляются к эпителию в органе-мишени, вторгаются в орган и в конечном итоге перерастают в новые очаги. 4 Хотя известно, что CTC имеют прогностическую значимость, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 их биология лишь частично понимается как результат их крайней редкости в CRC. 10
Модели мышей – мощные tOol для изучения различных аспектов биологии рака. Классические, подкожные опухолевые модели продуцируются путем подкожной инъекции опухолевых клеток мышам-реципиентам, которые могут быть либо иммунокомпетентными (если используются сингенные мышиные опухолевые клетки), либо иммунодефицитом. Модели подкожных опухолей являются недорогими и быстро производят данные; Их конечный рост опухоли может быть легко и неинвазивно измерен. Однако 88% новых соединений, которые продемонстрировали противоопухолевую активность в таких моделях, не проходят в клинических испытаниях. 11 Это отчасти связано с межвидовыми различиями между людьми и мышами; Однако большая часть этого отказа объясняется низким прогностическим значением подкожных моделей мыши.
Модели ортотопических мышей, в которых опухолевые клетки вводятся в орган происхождения и, таким образом, растут в их первоначальном микроокружении, поэтому все чаще используются в исследованиях рака. 11 , 12 , </sUp> 13 , 14 Ортотопические модели не только моделируют местные условия роста опухоли; В результате анатомически правильного участка роста опухоли модели ортотопической мыши также позволяют реалистичное моделирование метастазов и поэтому используются для изучения биологии 8 , 15 , 16 CTC или их реакции на различные методы лечения в CRC. 13 , 17
Основным недостатком ортотопических моделей мыши является их техническая сложность. В зависимости от органа, в который должны вставляться клетки, кривая обучения до тех пор, пока экспериментатор не сможет индуцировать воспроизводимые опухоли, довольно длительный. Это особенно относится к колоректальным раковым моделям, поскольку опухолевые клетки необходимо вводить в стенку кишечника, что часто приводит к перфорации, утечке опухолевых клеток или потере эндолюминальной опухолевой клетки. ЭтоЦелью настоящего изобретения является описание способа подготовки клеток из образцов первичной ткани, двумерных клеточных линий и трехмерной органоидной культуры и их инъекции в слепую мышь. Описанная здесь методика приводит к высокоравномерным опухолям и, в зависимости от биологии опухоли клеточной линии, используемой для инъекций, воспроизводимому образованию отдаленных метастазов и КТК у реципиентных мышей. 15
Несмотря на их доклинически доказанную активность в подкожных моделях мыши, подавляющее большинство новых соединений терпят неудачу в клинических испытаниях и никогда не попадают в клинику. 11 Эта очевидная недостаточность подкожных моделей мыши для точного моделирован?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Германским исследовательским фондом (WE 3548 / 4-1) и Роланд-Эрнст-Штифтун фюр-Гесундхицвезен (1/14).
Cell culture Media and Components | |||
Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
Buprenorphine | Temgesic | – | |
Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CTC isolation | |||
EDTA | Roth | 8040.1 | |
Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
PAP pen | Abcam | ab2601 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemistry | |||
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |