Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal
Summary
Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.
Abstract
A pesar de las ventajas de la fácil aplicabilidad y rentabilidad, los modelos de ratón subcutáneo tienen limitaciones severas y no simulan con precisión la biología tumoral y la diseminación de células tumorales. Se han introducido modelos de ratones ortotópicos para superar estas limitaciones; Sin embargo, estos modelos son técnicamente exigentes, especialmente en órganos huecos como el intestino grueso. Con el fin de producir tumores uniformes que crecen de forma fiable y metástasis, las técnicas estandarizadas de preparación e inyección de células tumorales son críticas.
Hemos desarrollado un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal (CRC) que desarrolla tumores muy uniformes y puede ser utilizado para estudios de biología de tumores, así como ensayos terapéuticos. Se inyectan células tumorales de tumores primarios, líneas de células bidimensionales (2D) o organoides tridimensionales (3D) en el ciego y, dependiendo del potencial metastásico de las células tumorales inyectadas, forman tumores altamente metastáticos. En adición,Los CTC se pueden encontrar regularmente. Aquí describimos la técnica de preparación de células tumorales tanto de líneas celulares 2D como de organoides 3D, así como el tejido tumoral primario, las técnicas quirúrgicas y de inyección, así como el aislamiento de CTCs de los ratones portadores de tumores y los consejos actuales para la resolución de problemas.
Introduction
El cáncer colorrectal (CCR) es una de las causas más comunes de muerte por cáncer en los países occidentales. 1 Mientras que el tumor primario a menudo puede ser resecado, la aparición de metástasis distantes empeora drásticamente el pronóstico y a menudo conduce a la muerte. 2 , 3 El correlato biológico de la metástasis son las células tumorales circulantes (CTC), que se separan del tumor, sobreviven en la circulación, se adhieren al epitelio en el órgano diana, invaden el órgano y en última instancia, crecen a nuevas lesiones. 4 Aunque se sabe que los CTC son de relevancia pronóstica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 su biología sólo se entiende en parte como resultado de su extrema rareza en la CRC. 10
Los modelos de ratón son un poderoso tOol para estudiar diversos aspectos de la biología del cáncer. Los modelos clásicos de tumores subcutáneos se producen mediante inyección subcutánea de células tumorales en ratones receptores, que pueden ser inmunocompetentes (si se utilizan células tumorales murinas singénicas) o inmunodeficientes. Los modelos de tumor subcutáneo son baratos y producen datos rápidamente; Su crecimiento tumoral de punto final puede ser medido fácilmente y no invasivamente. Sin embargo, el 88% de los nuevos compuestos que han demostrado actividad antitumoral en estos modelos fallan en ensayos clínicos. 11 Esto es en parte debido a las diferencias entre especies entre humanos y ratones; Sin embargo, una gran parte de este fracaso se debe al bajo valor predictivo de los modelos de ratones subcutáneos.
Los modelos de ratones ortotópicos, en los que las células tumorales se inyectan en el órgano de origen y, por tanto, crecen en su microambiente original, se utilizan cada vez más en la investigación del cáncer. 11 , 12 , </sUp> 13 , 14 Los modelos ortotópicos no sólo simulan las condiciones locales de crecimiento tumoral; Como resultado del sitio anatómicamente correcto del crecimiento tumoral, los modelos de ratón ortotópico también permiten la simulación realista de la metástasis y por lo tanto se usan para estudiar la biología del CTC 8 , 15 , 16 o su respuesta a diferentes tratamientos en la CRC. 13 , 17
Una de las principales desventajas de los modelos de ratones ortotópicos es su complejidad técnica. Dependiendo del órgano en el que se van a inyectar las células, la curva de aprendizaje hasta que el experimentador es capaz de inducir tumores reproducibles es bastante larga. Esto se aplica especialmente a los modelos de cáncer colorrectal, ya que las células tumorales necesitan ser inyectadas en la pared intestinal, lo que a menudo produce perforación, pérdida de células tumorales o pérdida endoluminal de células tumorales. Esto unEl objetivo de este artículo es describir el método de preparación celular a partir de muestras de tejido primario, líneas celulares 2D y cultivo organoide 3D y su inyección en el ciego de ratones. La técnica descrita aquí conduce a tumores muy uniformes y, dependiendo de la biología tumoral de la línea celular utilizada para inyección, la formación reproducible de metástasis a distancia y CTC en los ratones receptores. 15
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de su actividad preclínicamente probada en los modelos de ratones subcutáneos, la gran mayoría de los nuevos compuestos fallan en ensayos clínicos y nunca llegan a la clínica. 11 Esta insuficiencia evidente de modelos subcutáneos de ratón para simular con precisión los patrones de la biología y de crecimiento de los tumores ha conducido al desarrollo de modelos ortotópicos ratón basa en la inyección de las células tumorales directamente en el órgano original.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la fundación alemana de la investigación (WE 3548 / 4-1) y Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).
Materials
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine | Temgesic | – | |
| Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
- Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
- Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?. Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
- Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
- Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201 (2015).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82 (2013).
- Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
- Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
- Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
- Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107 (2014).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
- Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
- Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).
