Vi beskriver upprättandet av ortotopiska kolorektala tumörer via injektion av tumörceller eller organoider in i cecum av möss och efterföljande isolering av cirkulerande tumörceller (CTC) från denna modell.
Trots fördelarna med enkel användbarhet och kostnadseffektivitet har subkutana musmodeller allvarliga begränsningar och simulerar inte noggrant tumörbiologi och tumörcellspredning. Ortotopmusmodeller har införts för att övervinna dessa begränsningar; Sådana modeller är emellertid tekniskt krävande, speciellt i ihåliga organ som stor tjocktarm. För att producera likformiga tumörer som på ett tillförlitligt sätt växer och metastaserar är standardiserade tekniker för framställning och injektion av tumörceller kritiska.
Vi har utvecklat en ortotopisk musmodell av kolorektal cancer (CRC) som utvecklar högt likformiga tumörer och kan användas för tumörbiologiska studier såväl som terapeutiska försök. Tumörceller från antingen primära tumörer, 2 -dimensionella (2D) cellinjer eller 3-dimensionella (3D) organoider injiceras i cecum och beroende på metastatiska potentialen hos de injicerade tumörcellerna bildas mycket metastatiska tumörer. Dessutom,CTCs finns regelbundet. Vi beskriver här tekniken för tumörcellsberedning från både 2D-cellinjer och 3D-organoider, såväl som primärtumörvävnad, kirurgiska och injektionsteknikerna samt isolering av CTC från de tumörbärande mössen och nuvarande tips för felsökning.
Colorectal cancer (CRC) är en av de vanligaste orsakerna till cancerdöd i västra länder. 1 Även om den primära tumören ofta kan resekteras, försvårar förekomsten av avlägsna metastaser dramatiskt prognosen och leder ofta till döden. 2 , 3 Metastasens biologiska korrelat är cirkulerande tumörceller (CTC), som avlägsnas från tumören, överlever i cirkulation, fäster vid epitel i målorganet, invaderar orgeln och slutligen växer ut till nya skador. 4 Även om CTCs är kända för att vara av prognostisk relevans, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 är deras biologi förstås först delvis som ett resultat av deras extrema sällsynthet i CRC. 10
Musmodeller är en kraftfull tOol att studera olika aspekter av cancerbiologi. Klassiska subkutana tumörmodeller framställs genom subkutan injektion av tumörceller i mottagande möss, vilka kan vara antingen immunokompetenta (om syngene-ka murina tumörceller används) eller immunbristande. Subkutana tumörmodeller är billiga och producerar data snabbt; Deras slutpunkts-tumörtillväxt kan enkelt och icke-invasivt mätas. Emellertid misslyckas 88% av nya föreningar som har visat antitumöraktivitet i sådana modeller i kliniska prövningar. 11 Detta beror dels på interspecies skillnader mellan människor och möss. En stor del av detta misslyckande beror emellertid på det låga predictive värdet av subkutana musmodeller.
Ortotopmusmodeller, där tumörcellerna injiceras i ursprungsorganet och därmed växer i sin ursprungliga mikromiljö, används därför alltmer i cancerforskning. 11 , 12 , </sUp> 13 , 14 Ortotopiska modeller simulerar inte bara lokala tumörtillväxtbetingelser. Som ett resultat av den anatomiskt korrekta platsen för tumörtillväxt, tillåter ortototopmusmodeller också realistisk simulering av metastas och används därför för att studera CTC biologi 8 , 15 , 16 eller deras svar på olika behandlingar i CRC. 13 , 17
En stor nackdel med ortotopmusmodeller är deras tekniska komplexitet. Beroende på organet där cellerna ska injiceras är inlärningskurvan tills experimenten kan inducera reproducerbara tumörer ganska lång. Detta gäller särskilt för kolorektala cancermodeller, eftersom tumörcellerna måste injiceras i tarmväggen, vilket ofta resulterar i perforering, tumörcellsläckage eller endoluminal tumörcellsförlust. Detta aRticle är avsedd att beskriva metoden för cellpreparat från primära vävnadsprover, 2D-cellinjer och 3D-organoidkultur och deras injektion i muskottens cecum. Tekniken som beskrivs här leder till mycket likformiga tumörer och beroende på tumörbiologin hos cellinjen som används för injektion, reproducerbar bildning av avlägsna metastaser och CTC i mottagarmusen. 15
Trots sin prekliniskt beprövade aktivitet i subkutana musmodeller misslyckas den stora majoriteten av nya föreningar i kliniska prövningar och når aldrig till kliniken. 11 Denna uppenbara insufficiens av subkutana musmodeller för att exakt simulera biologiska och tillväxtmönster hos tumörer har lett till utvecklingen av ortopotopmusmodeller baserat på injektion av tumörceller direkt in i det ursprungliga organet.
Ortotopiska musmodeller kan simulera biologin…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (WE 3548 / 4-1) och Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).
Cell culture Media and Components | |||
Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
Buprenorphine | Temgesic | – | |
Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CTC isolation | |||
EDTA | Roth | 8040.1 | |
Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
PAP pen | Abcam | ab2601 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemistry | |||
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |