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Neurosciences

研究保護および腫瘍細胞の侵襲性をモデルとして脊髄海馬スライス培養

Published: August 27, 2017
doi:
10.3791/55359
, , ,
1Department of Anatomy and Cell Biology,Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Anatomy,University of Otago

Summary

切片海馬スライス培養 (一部は、OHSC) は、体内の状況を非常によくシミュレートする生体外モデルを表します。ここで述べる vibratome ベース新規物質の神経電位または腫瘍細胞の生物学的挙動の評価で使用するための高品質のスライスを取得するためのプロトコルをスライスを改善します。

Abstract

切片海馬スライスの文化 (一部は、OHSC) でニューロンとグリア細胞の形態学的および機能的な特性がよく保存されています。このモデルは、神経保護に関する研究、神経細胞、神経回路、または浸潤に関する電気生理学的実験を伴う研究問い合わせへの対応に適しています。海馬のアーキテクチャと海馬回路における神経細胞の活動がよく保存されている一部は、OHSC、にもかかわらずスライス手順自体初期病変とグリア瘢痕の形成につながる。など、小さな分子の拡散挙動と機械的性質、瘢痕形成はおそらく変更します。スライスは、動物の外科手術、各種脳由来細胞、アストロ サイト、ミクログリア、神経生理学的および病理学的下すなわち間相互作用の脳損傷後の時間依存プロセスの監視を許可します。条件。このモデルの相反する側面血流および血液の免疫細胞の不在であります。神経障害の進行、中に血液が重要な役割を果たすから免疫細胞の移行。それらの細胞はスライスで行方不明、文化の本質的なプロセスが外部に干渉しないで観察可能性があります。また、一部は、OHSC 媒体外部環境の組成物は、正確に制御されます。このメソッドのさらなる利点は、標準製剤と比較して犠牲にされた動物の数が少ないです。いくつか一部は、OHSC は 1 頭の動物に複数の治療法を同時研究を可能 1 つの動物から入手できます。これらの理由の一部は、OHSC は組織の損傷後や腫瘍の侵入の間に新しい保護治療の効果を分析する適しています。

提示プロトコルの一部は、OHSC 再現性の高い生成することができます準備方法を記述するここで、神経保護や腫瘍浸潤の研究のような実験的研究のさまざまな使用することができますスライスをよく保存します。

Introduction

一部は、OHSC 神経細胞、アストロ サイト、ミクログリア1の生理学的および病理学的性質の研究によ特徴付けられた生体外モデルであります。細胞外の環境をコントロールし、様々 な刺激の後細胞と形態学的変化を監視する簡単です。後準備2,3海馬ニューロンの組織とその接続がよく保存されています。いくつかの利点の一部は、OHSC は、動物の外科手術することがなく脳損傷およびがんの浸潤の監視を許可します。一部は、OHSC 6 〜 8 は、単一の齧歯動物の脳から入手できます。一部は、OHSC したがって大幅動物の数を減らすし、同じ動物では複数の薬物濃度、遺伝子操作または異なる病変モデルをテストできるようにするのに役立ちます。スライス ベースのアッセイでは、実験条件を正確に制御できます。また、二次被害のような病理学の条件の時間依存の開発はタイムラプス イメージングによる簡単に監視できます。

Stoppiniらによって最初に確立された特定のプロトコルに4、準備手順が記載されている、適切なスライスの選択の重要な形態学的なランドマークが強調表示されます。生後 7-9 ラットやマウス生後 4-5 の準備をお勧めします。これらの期間は、一部は、OHSC は、機械的外傷、神経回路の再編成の可能性が高い堅牢な抵抗性を示します。対照的に、萌芽期または成人ラットから準備急速に構造変更し栽培中の脊髄の形態を失う、したがって基礎研究5,6で長期的なプロセスを学ぶには適して,7,8,9,10,11. 一部は、OHSC の生存率のもう一つの重要なポイントは、拡散およびこうして栄養供給が限られた12,13,14スライス自体の厚さ。

Protocol

によってヨーロッパ コミュニティ評議会指令 2010年/63/EU 欧州議会を承認済みとして倫理ポリシーおよび神経科学研究の動物の使用に関する方針に従って動物実験を行ったと科学的な目的に使用される動物の保護に関する欧州連合理事会の。 1 器具文化メディア準備 の一部は、OHSC 準備のため楽器の次のセットを使用して、: 2 つの小さなはさみ、2 つピンセット?…

Representative Results

神経保護の研究:神経損傷、PI 肯定的な核と IB4 (DG) 歯状回の顆粒細胞層 (GCL) のすべての 3 番目の光学セクションにおけるミクログリアに数えられた正の数を確認します。腫瘍の侵入実験のためスタックの最大強度 z 投影は侵略と異なる侵入パターン (図 6) を視覚化する手段として腫瘍細胞によって覆われる領域を計算するた…

Discussion

この議定書では、一部は、OHSC の準備について説明します。このモデルは、組み込み機能と脳の反応の生理学的および病理学的刺激の適用後テストできます。ほかに電気生理学的パラメーターの解析では、一部は、OHSC は破壊することができます、あらゆる細胞に損傷の影響を決定できます。さまざまな物質と示したプロセスやマクロファージとリンパ球の不在で癒しの詳細な説明と治療が可…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、優れた技術的な援助のためのビデオ録画とハリッド Ghadban 彼女を扶養するクリスティン Auste を感謝したいです。ウルシュラ Grabiec は、ルーの Programm FKZ 29/18 によって支えられました。

Materials

6-Well Falcon 35-3046
Agar Fluka 5040
Autoclav Systec DX-45
CFDA  Thermo Fisher V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium  Invitrogen 32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Labs FL-1101
Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 Vector Labs FL-1201  
Glucose Merk 1083371000
Glutamin Invitrogen 25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) Invitrogen 24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+) Invitrogen 14170-138
Insulin Sigma Aldrich I5500
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960
L-Glutamin Invitrogen 25030-024
LN229 Cell-Lines-Service 300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) B.Braun 1050052
Millicell Culture Inserts Millipore PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich M3262
Normal Horse Seum Invitrogen 26050-088
Penicillin Streptomycin Invitrogen 15140-122
Petri dishes (all sizes) Greiner 627160/664160/628160
PFA Roth 0335.1 toxic
Propidium iodid (PI) Sigma Aldrich 81845-25MG toxic
U138 ATCC HTB-14
Vibratome Leica Leica VT 1200
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Organotypic Hippocampal Slice CulturesNeuroprotectionTumor Cell InvasivenessVibratomeAgar BlocksPreparation MediumCytoarchitectureCell Culture InsertCulture MediumInflammatory ReactionsNeuroprotection Studies
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Citer Cet Article
Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer, N., Dehghani, F. Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (126), e55359, doi:10.3791/55359 (2017).
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