Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Summary

Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.

Abstract

Les microglies sont les répondeurs principaux aux insultes du système nerveux central; Cependant, il reste encore beaucoup de leur rôle dans la régulation neuro-inflammation. Microglies sont des cellules mésodermiques qui fonctionnent de manière similaire aux macrophages dans le stress inflammatoire arpentage. Le classique (M1-type) et alternatif (M2 type) activations de macrophages ont également été étendues à microglie dans le but de mieux comprendre l'interaction sous-jacente de ces phénotypes ont dans des conditions neuro-inflammatoires telles que la maladie de Parkinson, d'Alzheimer et la maladie de Huntington. Dans l' expérimentation in vitro en utilisant la microglie primaire offre des résultats rapides et fiables qui peuvent être étendues à l'environnement in vivo. Bien que ce soit un net avantage sur l' expérimentation in vivo, l' isolement microglies tout en obtenant des rendements adéquats de pureté optimale a été un défi. Les méthodes courantes actuellement utilisées souffrent soit de faible récupération, de faible pureté, ou les deux. Ici, nous demontrer un perfectionnement du procédé de séparation magnétique CD11b sans colonne qui permet d'obtenir une récupération élevée de cellules et de pureté améliorée dans la moitié de la quantité de temps. Nous vous proposons cette méthode optimisée comme un modèle très utile d'isolement microglie primaire aux fins de l'étude et la neuro-inflammation neurodégénérescence.

Introduction

Les microglies sont macrophages résidents Myb indépendants d'origine mésodermique, qui se différencient à partir de c-kit + / CD45- érythromyéloïde progéniteurs dans les îlots sanguins de la vésicule ombilicale ^{1, 2.} Une fois embryologique microglie ont colonisé le système nerveux central (SNC), leur transition d'une amoeboid à une forme ramifiée ^3. Ces microglies adultes sont classés comme Surveillant puisque leurs ramifications dynamiques sonde le parenchyme cérébral sain pour les insultes potentiels ^4. Bien que les microglies ne contribuent à environ ....

Protocol

L'utilisation des animaux et des procédures de protocole ont été approuvés et supervisés par le Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC) à l'Iowa State University (Ames, IA, États-Unis)

1. Croissance des cultures mixtes gliales

1. 1- 2 chiots Décapitez âgés jour rapidement avec 5,5 pouces ciseaux d'exploitation, et placer les têtes immédiatement dans un tube de 50 ml sur la glace. Notez que cette décapitation est le mode d'euthanasie.
2. Dans une hotte à flux laminaire, une petite incision dans le crâne et les méninges en utilisant 4,5 p....

Results

Microglie isolés en utilisant le kit de sélection positive CD11b II ont une grande pureté

microglies de souris primaires ont été isolés en utilisant le protocole mentionné ci-dessus et étalées sur des lamelles revêtues de poly-D-lysine pour vérifier la pureté de l'isolement. Dix mille cellules ont été étalées par puits et l'analyse immunocytochimique a été effectuée en utilisant la molécule d'adaptateur de liaison du calcium ioni.......

Discussion

Anciennes méthodes d'isolement microgliales ont des recouvrements limités qui ne sont pas appropriés pour diverses analyses de protéines par Western Blot et des analyses ARN par qRT-PCR. L'adhérence différentielle et les méthodes de trypsinisation douces sont deux approches courantes avec de faibles rendements microgliales ^{13, 14, 15.} L'approche basée CD11b colonne de récupération est également faible, mais permet d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasySep CD11b Separation Kit II	StemCell Technologies	18970
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Life Technologies	11330057
Sodium Pyruvate	Life Technologies	11360070
MEM Acides aminés non essentiels (100x)	Life Technologies	11140050
L-Glutamine (100x)	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
Sérum de veau fœtal (FBS)	Sigma	13H469
0,25 % Trypsine-EDTA	Gibco de Life Technologies	25200
PBS de Dulbecco (DPBS)	Gibco de Life Technologies	14190250