Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes
Summary
Sequential extraction du sel de protéines chromatiniennes lié est un outil utile pour déterminer les propriétés de liaison de complexes protéiques importantes. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le rôle des sous-unités individuelles ou des domaines de l’affinité globale d’une protéine complexe en bloc de la chromatine.
Abstract
Élucider les propriétés de liaison de ciblage de la chromatine des protéines peut être très difficile en raison de la nature complexe de la chromatine et l’hétérogénéité des mammifères plus complexes modification de la chromatine. Afin de surmonter ces obstacles, nous avons adapté un test d’extraction séquentielle du sel (SSE) permettant d’évaluer les affinités de liaison relative de la chromatine lié aux complexes. Ce dosage facile et simple peut être utilisé par des non-spécialistes pour évaluer la différence relative affinité de deux complexes apparentés, les changements dans l’affinité d’un complexe quand une sous-unité est perdue ou d’un domaine individuel est inactivé et le changement de affinité de liaison après modification du paysage de la chromatine. Séquentiellement, re-suspension en vrac la chromatine en augmentant les quantités de sel, nous sommes en mesure de profil l’élution d’une protéine particulière de la chromatine. À l’aide de ces profils, nous sommes en mesure de déterminer l’incidence des altérations dans un complexe de modification de la chromatine ou modifications de l’environnement de la chromatine sur des interactions de liaison. SSE de couplage avec d’autres dosages in vitro et in vivo , nous pouvons déterminer les rôles des domaines individuels et des protéines sur les fonctionnalités d’un complexe à une variété d’environnements de chromatine.
Introduction
Règlement de l’ADN dans les cellules eucaryotes est un système complexe et sophistiqué qui est étroitement contrôlé par un assortiment de protéines que coordonner les réactions aux stimuli intracellulaires et extracellulaires. ADN est enroulé autour d’histone octamères aux nucléosomes forme, qui peuvent être plus ou moins répartis le long de l’ADN ou compactés en serpentins serré1. Cet arrangement structurels de l’ADN et les histones est connu comme la chromatine, qui est régulée par un réseau de protéines que lire, écrire et effacer les modifications post traductionnel (PTM) histones2. Certaines histones SPTM, tels que l’acétylation, changer la charge de l’acide aminé, ils sont déposés sur, modifier les interactions entre les histones et ADN2. Histone SPTM service aussi à recruter des régulateurs transcriptionnels, rénovateurs de la chromatine, machines de réparation des dommages ADN et machinerie de réplication de l’ADN à des régions spécifiques du génome3.
La plupart des méthodes pour étudier les interactions de la chromatine soit sonder les interactions à petite échelle ou impliquent de grandes analyses Génome-large. Études in vitro de liaison utilisent souvent des domaines individuels recombinants peptides histone ou ADN dans les essais comme les essais de déplacement de mobilité électrophorèse (EMSA), la calorimétrie isotherme de titration, polarisation de fluorescence et peptide pulldowns. Parce que ces tests se concentrent généralement sur un domaine de protéines individuelles, ils facilitent la compréhension d’un petit morceau du puzzle, mais ne nous permettent pas de comprendre la nature coopérative de protéines multi-domaine, sans parler de leur rôle en multi-protéines complexes. Une autre couche de complexité est ajoutée par la composition hétérogène de mammifères plus complexes modification de la chromatine. Cette hétérogénéité de protéine, en combinaison avec le caractère dynamique du paysage la chromatine, rend difficile de récapituler in vivo liant les interactions des protéines chromatiniennes à chromatine in vitro.
Méthodes in vivo ont fait des progrès considérables ; Cependant, ils sont souvent coûteux, chronophages et techniquement difficiles. Immunoprécipitation de la chromatine suivie par séquençage (ChIP-seq) est très utile pour déterminer la localisation des protéines et des modifications d’histone au sein du génome, mais il nécessite une optimisation importante4. Les protéines sont souvent réticulé à la chromatine de préserver des interactions ; Toutefois, cela peut produire des interactions artificielles et peut causer épitope masquant5. En outre, l’immunoprécipitation (IP) exige des anticorps hautement spécifiques et vaste optimisation des ADN cisaillement IP conditions par ChIP-qPCR en utilisant un site de liaison connue, ce qui n’est souvent pas disponible a priori. Après l’optimisation des conditions de la puce, traitement des échantillons est coûteuse et nécessite quelques semaines ou mois de séquencer et d’analyser. Bien que cette méthode est précieuse pour identifier la localisation de la chromatine lié protéines au sein du génome, le coût et engagement en temps rendre prohibitifs pour utiliser cette méthode pour générer des hypothèses sur comment les petits changements peuvent affecter des propriétés de liaison de global .
Dans cet article, nous décrivons comment un test d’extraction séquentielle du sel (SSE) peut être utilisé pour examiner les profils de liaison globale des protéines liées à la chromatine et distinguer comment des changements dans un profil PTM protéine complex ou global peuvent modifier les interactions. Bien que les extractions sels sont une technique couramment et largement utilisée, nous démontrons comment cette méthode séquentielle est hautement reproductible et polyvalent. SSE permet de caractériser la façon dont une seule sous-unité d’un immeuble ou même un seul domaine contribue à affinité globale du complexe de la chromatine globale. SSE permet également de déterminer si la liaison d’une protéine est influencée par les changements dans le paysage de la chromatine, fournissant des hypothèses intéressantes pour histone marque ciblant qui peuvent être confirmés à l’aide de ChIP-seq et autres études large de génome.
Nous avons initialement adapté cette méthode de Wu et al., d’examiner la fonction de Polybromo1 (PBRM1) dans la liaison de la PBAF la chromatine rénovateur6,7. En utilisant cette technique, nous avons déterminé le rôle de PBRM1 pour la liaison de la chromatine dans la chromatine PBAF complexe de remodelage et ensuite déterminer la contribution relative des six BROMODOMAINES individuels à cette fonction7.
Nous décrivons ici comment optimiser cette méthode pour explorer la liaison de la chromatine dans différents types de cellules, pour évaluer l’affinité relative de chromatine semblable modification complexes, afin d’examiner le déplacement d’une protéine de la chromatine par un inhibiteur chimique, et pour déterminer les effets de la liaison de la chromatine après modification du paysage de la chromatine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caractérisation des interactions de protéine et la chromatine par extractions sels est une méthode commune qui a été employée pendant des décennies14,15; Toutefois, il n’a pas été systématiquement optimisée avant de révéler son utilité complète. Nous montrons comment cette méthode séquentielle fournit un moyen rapid et peu coûteux de distinguer les changements dans la liaison de la chromatine, lorsque la protéine ou l’environnement est modifi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse de chercheur de V (V2014-004) et un érudit V plus award (D2016-030) de la Fondation de V pour la recherche sur le Cancer et un American Cancer Society institutionnels Research Grant (subvention de IRG ACS 58-006-53) vers le centre de l’Université de Purdue pour Cancer Recherche. E. G. P. était accompagnée d’une bourse de dotation supérieure Borch au département de pharmacologie moléculaire et chimie médicinale de la Purdue University.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes–many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -. M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta – Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
