Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano
Summary
Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.
Abstract
The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.
Introduction
trastornos del neurodesarrollo humanos, como microcefalia, sólo pueden ser poco estudiados en modelos animales debido al hecho de que los cerebros humanos tienen una superficie cortical extendida, una característica única que difiere de los animales no humanos.
Este aspecto hace que el desarrollo del cerebro humano un proceso complejo que no puede ser suficientemente estudiada en un 2D, en el sistema de cultivo celular in vitro. Emergentes técnicas de cultivo 3D permiten la generación de organoides similar a un tejido a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). La diferenciación in vitro de células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión en 3D permite la formación de diversos tipos de células de una manera oportuna y específica de la región, dando lugar a una manera organizada, tejido estratificado 1, 2, 3. Gracias a los laboratorios que fueron pioneras en tecnologías de cultivo 3D y desmitificado la complejidad de la formación de órganos, a partir de células madre,hemos desarrollado un método robusto de generar organoides cerebrales para delinear los eventos tempranos de desarrollo del cerebro humano y para modelar microcefalia in vitro 1, 2, 3. Es de destacar que se adaptó el método original desarrollado por Lancaster et al. para generar organoides cerebrales 1. Este método fue modificado de acuerdo a nuestras necesidades experimentales.
El objetivo de un estudio de Gabriel et al. fue analizar los mecanismos celulares y moleculares de mantenimiento de células madre neuronales durante el desarrollo del cerebro. Con el fin de hacer esto, un estudio mecanicista se realizó mediante el análisis de las células progenitoras neurales (CPN) en organoides cerebrales 3D derivados de un paciente microcefalia 4. Este paciente lleva una mutación en CPAP, una proteína centrosomal conservado necesario para la biogénesis de centrosoma 5. Un hipo ampliamente aceptadotesis es que microcefalia es el resultado de un agotamiento de la reserva de la APN, y esto podría ser debido o bien a la muerte celular o a la diferenciación prematura 1, 6, 7, 8, 9.
Mediante el análisis de las zonas ventriculares (VZS) de organoides cerebrales microcefalia, se ha demostrado que un número significativo de NPC someterse a la división celular asimétrica, a diferencia de organoides cerebrales derivadas de un donante sano 4. Extensos análisis microscópicos y bioquímicos de organoides cerebrales microcefálicos revelan un papel inesperado para la CPAP en el desmontaje cilios oportuna 4. Específicamente, CPAP mutado se asocia con el desmontaje cilio retardado y ciclo celular re-entrada retardada, lo que lleva a la diferenciación prematura de NPC 4. Estos resultados sugieren un papel de los cilios en la microcefalia y THEIR participación durante la neurogénesis y el tamaño del cerebro de control 10.
La primera parte de este protocolo es una descripción de un método de tres pasos para generar organoides cerebrales homogéneos. Como se mencionó antes, el protocolo Lancaster original fue adaptado y modificado para adaptarse a nuestro propósito 1. En primer lugar, iPSCs humanos se cultivan en un estado libre de alimentador definido en matriz de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Este paso evita las variaciones de cultivos de células madre pluripotentes alimentadoras-dependiente. En este protocolo, la inducción de la diferenciación neural para formar epitelio neural comienza directamente desde iPSCs. Al saltarse la etapa de formación del cuerpo embrioides (EB), la diferenciación procede neural en una manera más controlada y dirigida. Este enfoque limita la formación espontánea y no dirigida de otras capas de células germinales, tales como el mesodermo y endodermo. Mediante la aplicación de este protocolo, neuroesferas contienen rosetas neurales pueden ser cosechadas en el día 5 para EHS incrustación matriz y cultivo en suspensión estacionaria. El medio organoide utilizado para el tercer paso de nuestro protocolo se complementa con dorsomorphin y SB431542. Dorsomorphin es un inhibidor de molécula pequeña de la proteína morfogénica ósea (BMP), y SB431542 inhibe la ruta de TGF- / activina / nodal de señalización. La combinación de estos factores podría promover la diferenciación neural de manera más eficiente que el ácido retinoico solo 11, 12, 13, 14.
En conjunto, estas modificaciones permiten la generación reproducible de organoides cerebrales, con variaciones mínimas a través de organoides. Es importante destacar que, se aplicó este método para generar robustamente organoides cerebrales microcefálicos de iPSCs paciente, que llevan mutaciones en los genes que afectan a los centrosomas y la dinámica del ciclo celular.
La segunda parte de este protocolo da instrucciones para preparar brain organoides para el análisis y la interpretación de los defectos celulares en microcefalia. Esto incluye la fijación, cryosectioning, la tinción de inmunofluorescencia y análisis microscópico confocal. Este protocolo proporcionará al lector una descripción detallada de los resultados esperados y con la orientación para la interpretación.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCPH es un trastorno del desarrollo neurológico humano complejo que no puede ser recapitulado en modelos animales in vivo o in sencilla cultivo de células humanas se acerca in vitro. La manifestación clínica de MCPH comienza a aparecer durante el primer trimestre, cuando comienza temprano neurogénesis. Por lo tanto, organoides cerebrales 3D representan un sistema experimental fiable para modelar el desarrollo MCPH. Además, 3D organoides cerebro humano son un enfoque ideal ya que i) que permiten l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Estamos muy agradecidos a la instalación de la incrustación de tejidos y la facilidad de la base del microscopio de CMMC. Estamos muy agradecidos por las discusiones y soporte técnico proporcionados por los miembros del Laboratorio de Biología del centrosoma y el citoesqueleto. Agradecemos a Li Ming Gooi para la corrección del manuscrito.
Materials
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 ml | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
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