Подготовка Meiotic хромосомы спреды от мыши Spermatocytes
Summary
Мейоз является процесс развития, в которой формируются гамет через один раунд репликации ДНК и двух раундов хромосома сегрегации. Используя технику для подготовки meiotic хромосома спреды могут рассматриваться млекопитающих мейоз. Здесь мы демонстрируем способ подготовки поверхности распространение ядра от мыши сперматоцитах.
Abstract
Млекопитающих мейоз представляет собой динамичный процесс развития, который происходит в зародышевых клеток и могут быть изучены и характеризуется. С помощью метода распространения ядер на поверхности слайдов (а не снижается их с высоты), мы показываем оптимизированный технику на мыши сперматоцитах, который был впервые описан в 1997 году. Этот метод широко используется в лабораториях для изучения млекопитающих мейоз, потому что он дает множество высокого качества ядер претерпевает подэтажи профаза I. семенных канальцев, сначала помещаются в гипотонический раствор к набуханию сперматоцитах. Затем сперматоцитах выпускаются в раствор сахарозы для создания суспензии клеток, ядер распространяются на фиксатор пропитанной стеклянных скольжениях. После иммуноокрашивания разнообразия белков уместны meiotic процессов может быть проверен. Например можно легко визуализировать белков синаптонемного комплекса, трехстороннюю структуру, которая соединяет хромосомы осей/ядер гомолог вместе. Meiotic рекомбинации белки, которые участвуют в ремонте двухнитевые разрывы ДНК, гомологичная рекомбинация, также может быть immunostained для оценки прогрессирования профазе I. Здесь мы опишем и продемонстрировать в деталях техника широко используется для изучения млекопитающих мейоза в сперматоцитах от несовершеннолетних или взрослых самцов мышей.
Introduction
Мышей широко используются как организм модель для изучения мейоза у млекопитающих. Можно оценить как нормальные процессы развития, так и дефекты, которые происходят во время мейоза. Сроки и прогрессии характерных особенностей, которые происходят в профазе I и подэтажи, а также множество специфических белков, участвующих в процессах решающее значение для регулирования мейоз можно охарактеризовать в дикого типа и мутантов мышей. Несколько специализированных процессов, которые происходят во время мейоза, который учился в деталях (обзор в Генделя и Schimenti1). К ним относятся формирование ДНК двухручьевой перерыв (DSB) и ремонт, рекомбинации, формировании синаптонемного комплекса и хромосомы сегрегации.
Важным аспектом изучения meiotic процессов является возможность изучения ядер, содержащий гомологичных хромосом, которые разрешаются визуально и оптически лучше различать и идентифицировать подэтажи профаза I. профазе I состоит из 5 подэтажи которые характеризуются конкретные функции, включая формировании синаптонемного комплекса (SC). СК является трехсторонняя белка эшафот, что позволяет сопряжения и ДНК двухручьевой перерыв ремонт гомолог. Во время leptonema гомолог выровнять изложенные осевой элементы СК. Затем вложения центральных элементов синаптонемного комплекса во время zygonema облегчает спаривания и физической связи (Синапсис) между парами гомолог. Во время pachynema Синапсис гомолог становится полным и ДНК кроссоверы формируются из ремонта выберите населения двухнитевые разрывы ДНК через гомологичная рекомбинация. SC дизассемблирует во время diplonema, позволяя гомолог desynapse, но остаются прикрепленными на их центромеры и на участках ДНК кроссоверы. Наконец, во время diakinesis, гомолог recondense и происходит переход к метафазы1.
Исторически, поверхность распространение meiotic хроматина принесли несколько ядер, особенно тех, кто с ранних стадиях профазе I2. В результате эти методы были изменены для улучшения разделения клеток тканей (то есть яички или яичников), методика распространения meiotic хроматина, а доходность meiotic ядер высокого качества для оценки2,3, 4. Кроме того, этот метод оказался полезным в сохранении ядерного и хроматина связаны белков в ядрах meiotic как свидетельствуют опубликованные immunolocalization методы5,6,7. Таким образом, метод первоначально описано Питерс2 и продемонстрировали здесь урожайности многих отдельных взрыв Сперматоцит ядер, содержащие гомолог переживает leptotene, zygotene, pachytene, diplotene и diakinesis подэтажи профаза я.
Методика подготовки поверхности распространение ядер (также называется хроматином распространение анализ) широко используется для изучения мейоза в областях репродуктивного здоровья и ячейки биологии. Слайды, содержащие поверхности распространение ядер может быть впоследствии immunostained с антителами к протеинов интереса или подвергнут Серебряный пятнать и затем анализируются с помощью микроскопии. Метод аналогичен для мужчин и женщин мышей, хотя для самок мышей2были описаны изменения. Важно, чтобы не overmince семенных канальцев. Ядра должны также распространяться таким образом, чтобы после гомолог иммуноокрашивания и связанные протеины отчетливо видны с микроскопией. Поверхность распространение ядра может быть подготовлен в течение нескольких часов и либо immunostained немедленно или температуре-80 ° C для максимум 3 недели до оттаивания и иммуноокрашивания. Однако оптимальные результаты получаются лучше всего для некоторых белков если иммуноокрашивания выполняется немедленно или в течение 2 недель подготовки поверхности распространение ядер. Слайды можно immunostained с стандартным протоколом, с использованием антител для протеинов интереса, следуют инкубации с конъюгированные для флуоресцентных белков вторичные антитела или красители, а затем образ с флуоресцентной микроскопии8. На послеродовом день 15-21 существует достаточно ткани на пару семенников дикого типа приносить слайды 6-10, и старых мышей (включая взрослых) даст больше слайдов. Однако мышей дикого типа 6 недель и старше также даст более пост meiotic клетки (то есть сперматид) на слайдах, после иммуноокрашивания. Кроме того все подэтажи профаза я можно наблюдать в отношении несовершеннолетних и взрослых мышей. Яички от мужчины на послеродовых дней 10 до 15 принесет много больше leptotene и zygotene клеток. Мышей старше послеродовой дня 14-15 принесет больше pachytene и diplotene ядер.
Здесь мы опишем и продемонстрировать широко используется метод подготовки поверхности распространение ядра от мыши сперматоцитах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для получения большого количества ядер Сперматоцит хорошо спред, хорошее качество, наиболее важные шаги настоящего Протокола включают соответствующие инкубации время семенных канальцев в евр, соответствующие фарша из семенных канальцев, и техника, используемых для Суспензию клеток ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают технической помощи Abigail Харрис. Они также признают Паула Коэн и Ким Holloway для помогая оптимизировать протокол подготовки поверхности распространение ядра от мыши сперматоцитах. Авторы также признательны критических чтении рукописи, Карен Schindler.
Эта работа была поддержана NIH R01 GM106262 для K.M.B.
Materials
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
