Preparação de cromossomos se espalha a partir do Mouse espermatócitos
Summary
Meiose é o processo de desenvolvimento pelo qual gâmetas são formadas através de uma única rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação do cromossomo. Mamíferos meiose pode ser examinado, utilizando uma técnica para preparar os cromossomas se espalha. Aqui, vamos demonstrar um método de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.
Abstract
Mamíferos meiose é um processo dinâmico de desenvolvimento que ocorre em células germinativas e pode ser estudado e caracterizado. Usando um método para espalhar núcleos na superfície de slides (ao invés de deixá-los de altura), podemos demonstrar uma técnica otimizada em espermatócitos de rato que foi descrita pela primeira vez em 1997. Este método é amplamente utilizado em laboratórios para estudar mamíferos meiose porque produz uma infinidade de núcleos de alta qualidade, passando por substages da prófase I. seminíferos túbulos primeiro são colocados em uma solução hipotônica para inchar espermatócitos. Em seguida, espermatócitos são liberados em uma solução de sacarose para criar uma suspensão de células e núcleos são espalhados em lâminas de vidro encharcada de fixador. Na sequência de imunocoloração, uma diversidade de proteínas pertinentes aos processos meióticos pode ser examinada. Por exemplo, proteínas do complexo synaptonemáticos, uma estrutura tripartida que conecta os cromossomo eixos/núcleos de homologs juntos podem ser facilmente visualizadas. Proteínas de recombinação meiótica, que estão envolvidas na reparação de quebras da dobro-costa de DNA por recombinação homóloga, também podem ser immunostained para avaliar a progressão da prófase eu. Aqui descrevemos e demonstrar em detalhe uma técnica amplamente utilizada para estudar mamíferos meiosis em espermatócitos de ratos machos juvenis ou adultos.
Introduction
Ratos são usados extensivamente como um organismo modelo para estudar meiose em mamíferos. Ambos os processos de desenvolvimento normais e defeitos que ocorrem durante a meiose podem ser avaliados. A linha do tempo e a progressão das características salientes que ocorrem durante a prófase I e substages, bem como uma infinidade de proteínas específicas envolvidas nos processos fundamentais para a regulação da meiose pode ser caracterizado no tipo selvagem e ratos mutantes. Vários processos especializados que ocorrem durante a meiose, que pode ser estudado em detalhe (revisto em Handel e Schimenti1). Estes incluem formação de ruptura da dobro-Costa (DSB) de DNA e reparação, recombinação, formação de complexos synaptonemáticos e segregação do cromossomo.
Um aspecto importante de estudar processos meióticos é a capacidade de examinar os núcleos contendo cromossomos homólogos que são visualmente e opticamente resolvidos para melhor distinguem e identificam os substages da prófase I. prófase que é composto por 5 substages que são caracterizadas por características específicas, incluindo a formação do complexo synaptonemáticos (SC). O SC é um andaime proteína tripartite que permite emparelhamento e DNA dobro-Costa reparação de homologs. Durante leptonema, homologs alinhar como elementos axiais do SC são estabelecidos. Em seguida fixação dos elementos centrais para o complexo de synaptonemáticos durante zygonema facilita a conexão física e pareamento (sinapse) entre pares de homologs. Durante pachynema, sinapse de homologs torna-se completa e os cruzamentos de DNA são formados a partir de reparação de uma população seleto de DNA dupla-quebras através de recombinação homóloga. O SC desmonta durante diplonema, permitindo homologs para desynapse, mas permanecem conectados em seus centrómeros e em locais de cruzamentos de DNA. Finalmente, durante diacinese, homologs recondense e ocorre a transição para a metáfase1.
Historicamente, superfície-propagação da cromatina meiótica rendeu alguns núcleos, especialmente aqueles das primeiras fases da prófase eu2. Como resultado, esses métodos foram modificados para melhorar a separação de células de tecidos (testículo ou ovário), a técnica de espalhamento de cromatina meiótica e o rendimento dos núcleos meiótico de alta qualidade para avaliação2,3, 4. Além disso, este método provou para ser útil na preservação nuclear e cromatina ligado proteínas em núcleos meióticos, como demonstrado por técnicas de immunolocalization publicada a5,6,7. Portanto, o método inicialmente descrito por Peters2 e demonstrado aqui rende muitos núcleos de maturação explosão separado contendo homologs passando pelos leptóteno, zygote, paquíteno, diplóteno e diacinese substages da prófase eu.
A técnica de preparação de superfície-propagação núcleos (também chamados de análise de propagação de cromatina) é amplamente utilizada para estudar meiose nos campos da biologia reprodutiva e celular. Slides contendo núcleos de propagação da superfície podem ser posteriormente immunostained com anticorpos para proteínas de interesse ou submetidos a coloração prata e depois analisaram com microscopia. O método é semelhante para os ratos masculinos e femininos, embora modificações foram descritas para ratos fêmeas2. É crucial para não overmince túbulos seminíferos. Núcleos devem também ser bem espalhados para que seguir immunostaining homologs e proteínas associadas são claramente vistas com microscopia. Núcleos de propagação da superfície podem ser preparados em apenas algumas horas e qualquer immunostained imediatamente ou armazenados a-80 ° C por um período máximo de 3 semanas antes de descongelar e imunocoloração. No entanto, óptimos resultados melhores são obtidos para algumas proteínas se immunostaining é executada imediatamente, ou dentro de 2 semanas de preparação de superfície-propagação núcleos. Slides podem ser immunostained com um protocolo padrão usando anticorpos para proteínas de interesse, seguido de incubação com anticorpos secundarios conjugados para fluorescente proteínas ou corantes, em seguida, fotografada com microscopia de fluorescência8. No pós-Natal dia 15-21 há tecido suficiente por par de tipo selvagem testículos a produzir slides de 6-10, e os ratos mais velhos (incluindo adultos) produzirá mais slides. No entanto, ratos de tipo selvagem 6 semanas de idade e mais velhos também irão produzir mais pós-meiose células (ou seja, espermátides) nas corrediças de imunocoloração a seguir. Além disso, todos os substages da prófase eu pode ser observado em ratos jovens e adultos. Os testículos dos machos no pós-natal dias 10 a 15 renderá muitos mais células leptóteno e zygote. Os ratos mais velhos que pós-Natal dia 14 a 15 renderá mais núcleos paquíteno e diplóteno.
Aqui descrevemos e demonstrar um método amplamente utilizado de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obter o elevado número de núcleos de maturação bem espalhados, de boa qualidade, as etapas mais críticas do presente protocolo incluem o tempo de incubação apropriada dos túbulos seminíferos no HEB, apropriado de picagem de túbulos seminíferos, e a técnica empregada para a suspensão de células de sacarose se espalhou o fixador slides revestido. Nós incubar túbulos seminíferos dos testículos dos machos de tipo selvagem, variando de pós-Natal dia 15 à idade adulta em HEB para 45 min, enquanto os te…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem a assistência técnica da Abigail Harris. Eles também reconhecem Paula Cohen e Kim Holloway para ajudar a otimizar o protocolo de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato. Os autores também apreciam a leitura crítica do manuscrito por Karen Schindler.
Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 GM106262 para K.M.B.
Materials
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
