Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro en In Vivo expressie van menselijke TCRs
Summary
De huidige protocol combineert eencellige gekoppeld menselijke TCR alpha en beta keten sequencing met gestroomlijnd generatie van retrovirale vectoren compatibel met in vitro en in vivo TCR expressie.
Abstract
Hoewel verschillende methoden voor het rangschikken van gepaarde T-cel receptor (TCR) Alfa en bèta ketens uit één T cellen hebben ontwikkeld, zijn geen tot nu toe bevorderlijk voor downstream in vivo functionele analyse van TCR heterodimers. We hebben een verbeterde protocol op basis van een tweestaps multiplex-genest PCR, wat resulteert in een PCR product dat omspant de hele variabele regio’s van een menselijke TCR Alfa en bèta ketens ontwikkeld. Door het unieke beperkingsplaatsen identificeren en hen op te nemen in de PCR inleidingen, hebben we het PCR product compatibel gemaakt met directe sub-kloont in de sjabloon retrovirale vector. De resulterende retrovirale construct codeert een chimeer mens/muis TCR met een muis intracellulaire domein, die functioneel in muis cellen of in vivo Muismodellen. Over het algemeen combineert het protocol hier beschreven menselijke eencellige gekoppeld TCR Alfa en beta keten identificatie met gestroomlijnde generatie van retrovirale vectoren gemakkelijk aanpasbaar voor in vitro en in vivo TCR expressie. De video en het begeleidende materiaal zijn ontworpen om een zeer gedetailleerde beschrijving van de eencellige PCR, zodat de kritische stappen gevolgd en potentiële valkuilen vermijden worden kunnen. Daarnaast bieden wij een gedetailleerde beschrijving van de klonen stappen die nodig zijn voor het genereren van de expressie-vector. Eenmaal onder de knie, kon de hele werkwijze vanaf één cel Sorteren op expressie van de TCR worden uitgevoerd in een korte periode van twee weken.
Introduction
De T-cel receptor (TCR) dicteert T Celgedrag tijdens ontwikkeling, steady-state/homeostase en antigene stimulatie in de periferie1,2,3. Recente uitbreiding van diepe sequencing technologieën heeft ontdekt een eerder ondergewaardeerde TCR diversiteit binnen antigeen specifieke T cel reacties. TCR diversiteit suggereert een potentieel voor functioneel brede T cel reacties. Teneinde de TCR sequentieanalyse repertoire met TCR functionele testen, moeten de sequencing-benaderingen worden ontworpen om verenigbaar met experimentele systemen en in vivo modellen gebruikt voor latere functionele analyse van select TCRs. We hebben een efficiënte aanpak voor menselijke TCR volgorde isolatie ontwikkeld en gestroomlijnd sub-kloont in een chimeer mens/muis TCR sjabloon vector compatibel met TCR expressie in HLA-gehumaniseerd muizen4. Isolatie van overeenkomstige Alfa en bèta ketens van heterodimeric TCRs vereist PCR versterking van beide ketens van een enkele cel. Hoewel verscheidene eencellige TCR klonen protocollen zijn ontwikkeld en gebruikt, zijn geen tot nu toe gemakkelijk compatibel met high-throughput gestroomlijnde directe klonen van onbekende Vα/Vβ TCRs in retrovirale vectoren nodig voor opnieuw uitdrukking in vivo 4,5,6,7. Eerdere studies hebben gebruikt twee belangrijke benaderingen, hetzij om selectief versterken een beperkt gedeelte van de TCR voldoende te extrapoleren de volgorde of te versterken van de gehele TCR reeks4,5,6 , 7. downstream functionele analyse van TCR sequenties verkregen via de eerste benadering vereist kostbaar in silico vergadering en DOVO bouw van de TCR. Terwijl de tweede benadering de volledige sequentie van de TCR biedt, is de menselijke constante regio niet compatibel met in vivo uitdrukking van de gekloonde TCRs in muismodellen. Onze aanpak is speciaal ontworpen om compatibel met in vivo functionele analyse van TCRs in muismodellen. We ontwikkelden een efficiënte en gestroomlijnde eencellige PCR protocol dat zorgt voor directe sub klonen van PCR fragmenten in de sjabloon expressie vector.
Onze aanpak maakt gebruik van een hooggevoelige multiplex-genest PCR-reactie die is uitgevoerd in twee stappen. In de eerste reactie van de multiplex stap een zwembad van 40 primers specifiek voor alle V-beta-ketens en een zwembad van 44 primers specifiek voor alle de V-alpha-ketens worden gebruikt voor het versterken van de TCR-alpha of TCR-beta zonder de voorkennis van de reeks (tabel 1). De voorwaartse primer heeft een adapter-reeks, die is opgenomen in de 5′ van het PCR-product. De omgekeerde primer is gebaseerd op de constante regio van de TCR. We hebben geconstateerd dat unieke beperkingsplaatsen die afwezig uit menselijke variabele of junction TCR gebieden en verwerkt deze in nieuw ontworpen TCRα en TCRβ inleidingen (Figuur 1). In de tweede geneste reactie, worden een primers specifiek voor de opeenvolging van de adapter en een geneste omgekeerde primer binnen de constante regio gebruikt voor het verder versterken van de TCR kettingen met hogere specificiteit (tabel 1, Figuur 1). Na enkele cel isolatie, twee rondes van PCR (eerste reactie met een pool van zowel Vα als Vβ inleidingen, en ten tweede met adapter inleidingen) resulteren in een PCR product dat kan worden direct sub gekloond in de sjabloon retrovirale vector. De uiteindelijke constructie van de TCR codeert, in een enkele open leesraam (ORF), menselijke variabele regio’s gecombineerd met muis constant regio’s verbonden via het ‘zelf verbrijzelen’ eiwit sequentie, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. De volgorde van P2A is gebruikt in meerdere systemen, en is uitgebreid getest speciaal voor de expressie van TCRs8,9,10,11. Hoewel, na vertaling allermeest naar de P2A volgorde blijft gekoppeld aan de C-terminus van de alpha keten verbonden door een flexibele linker, terwijl de bèta keten signaal reeks een extra proline, deze wijziging heeft heeft geen nadelig effect op de TCR functie. De muis constant regio wordt gebruikt in de constructie in plaats van de mens om te voorkomen dat eventuele gewijzigde interacties met stroomafwaartse signalering onderdelen wanneer opnieuw uitgedrukt in muis cellen. De één ORF zal resulteren in stoichiometrische aparte expressie van Alfa en bèta ketens9,11. Het huidige protocol is gebaseerd op de reagentia en benaderingen die wijd beschikbaar zijn, en is ontworpen om te worden uitgevoerd in een gestroomlijnde en efficiënte manier. Hoewel we specifiek deze techniek gebruikt hebben om te TCRs uit zelfontledende T cellen betrokken bij auto-immuunziekte diabetes assay, verwachten wij dat dit protocol kan zijn breed toepasbaar voor identificatie en beoordeling van de functionele van menselijke TCRs specifiek voor auto-immune epitopes, kanker epitopes of reacties op pathogenen en vaccins.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het huidige protocol beschrijven we een efficiënte methode voor eencellige TCR versterking en latere sub-kloont van gepaarde TCR Alfa en bèta ketens in een sjabloon retrovirale expressie vector. Hoewel verscheidene eencellige PCR protocollen hebben ontwikkeld, zijn geen tot nu toe compatibel met onmiddellijke sub-kloont in een expressie-vector. In de meeste gevallen wordt een partiële sequentie omvat de zeer variabel CDR3 regio’s versterkt, met genoeg opeenvolging te extrapoleren de variabele regio. Deze kleinere g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ, en de Robert en Janice McNair Foundation.
Wij danken Sandra Pena en Andrene McDonald patiënt aanwerving, Samuel Blum voor technische bijstand, Dr. George Makedonas voor de gave van antilichamen en controle DNA gebruikt voor PCR Optimalisering.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
- Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
- Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).
- Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153 (4), 785-796 (2013).
- Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. , (2016).
- Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).
- Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).
- Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).
