简化的单细胞 TCR 分离和逆转录病毒载体的生成, 用于体外和体内表达人类 TCRs
Summary
当前的协议结合了单细胞配对人类 TCR α和β链测序与与体外和体内TCR 表达相兼容的反转录病毒载体的生成。
Abstract
虽然, 有几种方法的排序的配对 t 细胞受体 (TCR) α和β链从单一 t 细胞已经开发, 迄今没有有利于下游体内功能分析的 TCR heterodimers。我们已经开发了一个改进的协议的基础上 two-step 多重嵌套 pcr, 这导致一个 pcr 产品横跨整个可变区域的人类 TCR α和β链。通过确定独特的限制点, 并将它们纳入 pcr 引物, 我们已经使 pcr 产品与直接 sub-cloning 与模板逆转录病毒载体相兼容。由此产生的逆转录病毒构建编码一个嵌合的人/鼠 TCR 与鼠标的细胞内域, 这是功能在鼠标细胞或在体内鼠标模型。总的来说, 这里描述的协议结合了人类单细胞配对 TCR α和β链识别与简化的逆转录病毒载体易于适应体外和体内TCR 表达。视频和伴随的材料被设计为对单细胞 PCR 的高度详细的描述, 因此关键的步可以被跟随和潜在的陷阱避免。此外, 我们还提供了生成表达载体所需的克隆步骤的详细描述。一旦掌握, 从单细胞排序到 TCR 表达的整个过程可以在短短的两周内完成。
Introduction
t 细胞受体 (TCR) 指示 t 细胞命运决定在发展期间, 稳态/稳态, 和抗原刺激的外围1,2,3。最近的深度测序技术的扩展揭示了先前未被低估的抗原特异 T 细胞反应中的 TCR 多样性。TCR 多样性表明了功能广泛的 T 细胞反应的潜力。为了将 TCR 序列剧目分析与 TCR 功能分析相结合, 测序方法应设计为与实验系统兼容, 并用于后续的功能性研究的体内模型。TCRs我们已经开发了一个有效的方法, 人类 TCR 序列隔离和简化 sub-cloning 成嵌合体的人/小鼠 TCR 模板载体与 TCR 表达的 HLA-人性化的老鼠4。heterodimeric TCRs 的相应α和β链的分离需要从单个细胞中扩增两个链。虽然, 已经开发和利用了几个单细胞的 TCR 克隆协议, 但迄今为止, 没有一个能够很容易地与高通量简化的 Vα/Vβ TCRs 的直接克隆相兼容, 成为重新体内的反转录病毒载体 4、5、6、7。以前的研究采用了两种主要方法, 要么是有选择地放大 TCR 的有限部分足以推断序列, 要么放大整个 TCR 序列4,5,6,7. 通过第一种方法获得的 TCR 序列的下游功能分析需要昂贵的在硅片中程序集和de 从头构造 TCR。虽然第二种方法提供完整的 TCR 序列, 但人的恒定区域与在鼠标模型中克隆的 TCRs 的在体内表达不兼容。我们的方法是专门设计为与在体内的功能分析 TCRs 在小鼠模型中兼容。我们开发了一个高效和简化的单细胞 pcr 协议, 允许直接 sub-cloning pcr 片段到模板表达载体。
我们的方法采用了一个高度敏感的多重嵌套 PCR 反应, 这是两个步骤执行。在第一个复用反应步骤中, 所有 v-β链的40引物的池, 以及所有 v 型α链专用的44个引物池, 用于放大 TCR-α或 TCR-beta, 而无需事先了解序列 (表 1)。前引物有一个适配器序列, 这是纳入 PCR 产品的 5 “。反向底漆基于 TCR 的恒定区域。我们已经确定了在人类变量或连接 TCR 区域中不存在的唯一限制站点, 并将它们合并到新重新设计的 TCRα和 TCRβ引物 (图 1) 中。在第二个嵌套反应中, 使用在恒定区域内的适配器序列和嵌套反向底漆的底漆, 用于进一步放大 TCR 链, 增加特异性 (表 1,图 1)。单细胞分离后, 两轮 pcr (第一反应与池的 Vα和 Vβ引物, 第二次与适配器引物) 产生的 pcr 产品, 可以直接 sub-cloned 到模板逆转录病毒载体。最后的 TCR 结构将编码, 在一个单一的开放阅读框架, 人的可变区域结合的小鼠恒定区域连接的 ‘ self-cleaving ‘ 蛋白序列, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8。P2A 序列已在多个系统中使用, 并已被广泛测试, 专门用于表达 TCRs8、9、10、11。虽然, 在翻译以后多数 P2A 序列仍然附有由一个灵活的链接器连接的阿尔法链子的 C 末端, 而 beta 链信号序列有另外的脯氨酸, 这种修改对 TCR 作用没有有害作用。在构造中使用鼠标常量区域, 而不是人类, 以避免 re-expressed 在鼠标单元格中时与下游信号组件的潜在改变的交互。单一的, 将导致化学计量独立表达α和β链9,11。目前的协议是基于广泛可用的试剂和方法, 并且设计为以流线型和高效的方式进行。虽然我们已经明确地使用这项技术来检测 TCRs 从反应 T 细胞牵连自身免疫性糖尿病, 我们预计, 该协议可以广泛适用于识别和功能评估的人 TCRs 具体自身免疫表位, 肿瘤抗原表位, 或对病原体和疫苗的反应。
Protocol
Representative Results
Discussion
在当前的协议中, 我们描述了一个有效的方法单细胞 TCR 放大和随后的 sub-cloning 配对 TCR α和β链成模板逆转录病毒表达载体。虽然, 已经开发了几个单细胞 PCR 协议, 到目前为止没有与直接 sub-cloning 兼容到表达载体。在大多数情况下, 包含高度可变的 CDR3 区域的部分序列被放大, 具有足够的序列来推断变量区域。这种较小的 pcr 产品尺寸支持更高的 pcr 效率, 但需要de 从头TCR 基因合成功能研究?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由 JDRF 1-2014-243-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 飞行员 PJ, 和罗伯特和珍妮丝捷基金会资助。
我们感谢桑德拉和 Andrene 麦当劳的耐心招聘, 塞缪尔. 布鲁姆为技术援助, Dr. 乔治 Makedonas 的礼物抗体和控制 DNA 用于 PCR 优化。
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
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