Strømlinet enkelt celle TCR Isolation og Generation af Retroviral vektorer for In Vitro og In Vivo udtryk for menneskelige TCRs
Summary
De nuværende protokol kombinerer enkelt celle parret menneskelige TCR alfa og beta kæde sekventering med strømlinet generation af retroviral vektorer kompatibel med in vitro- og i vivo TCR udtryk.
Abstract
Selv om flere metoder til sekvensering af parret T-celle receptoren (TCR) alpha og beta kæder fra enkelt T celler er blevet udviklet, har ingen hidtil været befordrende for downstream i vivo funktionel analyse af TCR heterodimers. Vi har udviklet en forbedret protokol baseret på en to-trins multiplex-indlejret PCR, hvilket resulterer i et PCR-produkt, der strækker sig over hele variable regioner af en menneskelig TCR alfa og beta kæder. Ved at identificere entydig begrænsning websteder og indarbejde dem i PCR-primere, har vi gjort PCR produkt kompatibelt med direkte sub kloning til skabelon retroviral vektor. Den resulterende retroviral konstruere koder en kimære menneskelige/mus TCR med en mus intracellulære domæne, som er funktionelle i mus celler eller i vivo musemodeller. Samlet set kombinerer protokollen beskrevet her menneskelige enkelt celle parret TCR alfa og beta kæde identifikation med strømlinede generation af retroviral vektorer let kan tilpasses til in vitro- og i vivo TCR udtryk. Videoen og den ledsagende materiale er designet til at give en meget detaljeret beskrivelse af den enkelte celle PCR, således at de kritiske trin kan være fulgt og potentielle faldgruber undgås. Derudover giver vi en detaljeret beskrivelse af de nødvendige til at generere udtryk vektor kloning skridt. Når styr, kunne hele proceduren fra enkelt celle sortering til TCR udtryk udføres i en kort periode på to uger.
Introduction
T-celle receptoren (TCR) dikterer T-celle skæbne beslutning under udvikling, steady state/homøostase og antigene stimulation i periferien1,2,3. Seneste udvidelse af dyb sekventering teknologier har afdækket en tidligere underappreciated TCR mangfoldighed inden for antigen specifikke T-celle svar. TCR mangfoldighed antyder et potentiale for funktionelt bred T-celle svar. For at integrere TCR Sekvensanalyse repertoire med TCR funktionelle assays, bør sekventering strategier være udformet til at være kompatibel med eksperimentelle systemer og i vivo modeller udnyttede efterfølgende funktionel analyse af Vælg TCRs. Vi har udviklet en effektiv tilgang til menneskelige TCR sekvens isolation og strømlinet sub kloning til en kimære menneskelige/mus TCR skabelon vektor kompatibel med TCR udtryk i HLA-humaniseret mus4. Isolering af tilsvarende alpha og beta kæder af heterodimerisk TCRs kræver PCR-amplifikation af begge kæder fra en enkelt celle. Selv om flere encellede TCR kloning protokoller er blevet udviklet og udnyttet, har ingen hidtil været let forenelig med høj overførselshastighed strømlinet direkte kloning af ukendt Vα/Vβ TCRs i retroviral vektorer nødvendige for fornyet udtryk in vivo 4,5,6,7. Tidligere undersøgelser har udnyttet to vigtigste tilgange, enten til selektivt forstærke en begrænset del af TCR tilstrækkeligt at ekstrapolere sekvensen, eller til at forstærke den hele TCR sekvens4,5,6 , 7. downstream funktionel analyse af TCR sekvenser opnået via den første tilgang kræver dyre i siliciummangan forsamling og de novo konstruktion af TCR. Mens den anden tilgang giver den komplette TCR sekvens, er den menneskelige konstant region ikke kompatibel med i vivo udtryk af de klonede TCRs i musemodeller. Vores tilgang er specielt designet til at være kompatibel med i vivo funktionel analyse af TCRs i musemodeller. Vi udviklet en effektiv og strømlinet enkelt celle PCR-protokol, der giver mulighed for direkte sub kloning af PCR fragmenter i skabelonen udtryk vektor.
Vores tilgang udnytter en meget følsomme multiplex-indlejret PCR reaktion, der er udført i to trin. I den første multiplex reaktion trin en pulje af 40 primere specifikke for alle V-beta kæder og en pulje af 44 primere specifikke for alle V-alpha kæder er brugt til at forstærke TCR-alpha eller TCR-beta uden forudgående kendskab til sekvensen (tabel 1). Den forreste primer har en adapter sekvens, som er indarbejdet i 5′ af PCR-produktet. Den omvendte primer er baseret på konstant regionen af TCR. Vi har identificeret entydig begrænsning websteder, der er fraværende fra menneskelige variabel eller krydset TCR regioner, og indarbejdet disse i nydesignede TCRα og TCRβ primere (figur 1). I den anden indlejrede reaktion bruges en specifik for adapter sekvens primer og en indlejret omvendt primer inden for regionen konstant til at yderligere forstærke TCR kæder med øget specificitet (tabel 1, figur 1). Efter enkelt celle isolation, to runder af PCR (første reaktion med en pulje af både Vα og Vβ primere, og for det andet med adapter primere) resultere i et PCR-produkt, der kan være direkte sub klonet i skabelonen retroviral vektor. Den endelige TCR konstruktion vil indkode, i en enkelt åben behandling ramme (ORF), menneskelige variable regioner kombineret med mouse konstant regioner forbundet med den ‘selvstændig cleaving’ protein sekvens, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A sekvens er blevet brugt i flere systemer, og er blevet grundigt testet specielt til udtryk i TCRs8,9,10,11. Selv efter oversættelse de fleste af P2A sekvens forbliver knyttet til C-terminus af alfa kæden forbundet med en fleksibel linker, mens beta kæde signal sekvensen har en ekstra prolin, denne ændring har nogen skadelig indvirkning på TCR funktion. Regionen mus konstant bruges i konstruktionen i stedet for menneskelige for at undgå potentielle ændrede interaktioner med downstream signaling komponenter når re udtrykt i mus celler. Den eneste ORF vil resultere i støkiometriske separat udtryk for alpha og beta kæder9,11. Den nuværende protokol er baseret på reagenser og tilgange, der er bredt tilgængelige, og er designet til at være udført på en strømlinet og effektiv måde. Selv om vi har specielt brugt denne teknik til analysen TCRs fra self-reactive T celler impliceret i autoimmune diabetes, forventer vi, at denne protokol kan være almindeligt gældende for identifikation og funktionel vurdering af menneskelige TCRs bestemt for autoimmun epitoper, kræft epitoper eller svar til patogener og vacciner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den nuværende protokol beskriver vi en effektiv metode til enkelt celle TCR forstærkning og efterfølgende sub kloning af parret TCR alfa og beta kæder i en skabelon retroviral udtryk vektor. Selv om flere enkelt celle PCR-protokoller er blevet udviklet, har ingen hidtil været forenelig med øjeblikkelig sub kloning til et udtryk vektor. I de fleste tilfælde forstærkes delsekvens omfatter de meget varierende CDR3 regioner med nok sekvens til at ekstrapolere den variable region. Denne mindre PCR produktstørrelse …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelsen blev finansieret af JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ, og The Robert og Janice McNair Foundation.
Vi takker Sandra Pena og Andrene McDonald for patient rekruttering, Samuel Blum for teknisk bistand, Dr. George Makedonas til gave af antistoffer og kontrol DNA anvendes til PCR optimering.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
- Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
- Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).
- Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153 (4), 785-796 (2013).
- Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. , (2016).
- Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).
- Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).
- Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).
