Rationalisé unicellulaire TCR isolement et génération des vecteurs rétroviraux pour In Vitro et In Vivo Expression de TCRs humaines
Summary
Le cours combine protocole unicellulaire jumelé humain séquençage de TCR alpha et bêta de chaîne avec simplifié génération des vecteurs rétroviraux compatibles avec l’expression de TCR in vitro et in vivo .
Abstract
Bien que plusieurs méthodes de séquençage d’appariés T cell receptor (TCR) alpha et bêta chaînes de cellules T ont été développés, aucun jusqu’à présent ont été propices à l’aval en vivo analyse fonctionnelle des hétérodimères TCR. Nous avons développé un protocole amélioré basé sur une PCR en deux étapes de multiplex imbriquées, qui se traduit par un produit PCR qui s’étend sur les régions variables entières d’une chaînes humaines TCR alpha et bêta. Par identification des sites de restriction uniques et leur intégration dans les amorces PCR, nous avons fait le produit PCR compatible avec direct sous clonage dans le vecteur rétroviral de modèle. La construction rétrovirale qui en résulte encode une chimérique humain/souris TCR avec un domaine intracellulaire de la souris, qui est fonctionnel dans les cellules de souris ou de modèles de souris in vivo . Dans l’ensemble, le protocole décrit ici combine humaine seule cellule jumelé TCR alpha et bêta chaîne identification avec génération simplifiée des vecteurs rétroviraux aisément adaptables pour l’expression de TCR in vitro et in vivo . La vidéo et le matériel qui l’accompagne sont conçus pour donner une description très détaillée de la cellule unique PCR, afin que les étapes critiques puissent être suivies et potentiels pièges évités. En outre, nous fournir une description détaillée des étapes nécessaires pour générer le vecteur d’expression clonage. Une fois maîtrisé, tout le processus depuis la seule cellule de tri à l’expression de TCR peut être effectué dans un délai de deux semaines.
Introduction
Le récepteur des cellules T (TCR) dicte décision sort des lymphocytes T au cours de développement, l’état stationnaire/homéostasie et une stimulation antigénique en périphérie1,2,3. Expansion récente des technologies de séquençage de profondeur a permis de découvrir une diversité TCR précédemment sous-estimé au sein de l’antigène des lymphocytes T spécifiques aux réponses. Diversité des TCR suggère un potentiel pour les lymphocytes T large point de vue fonctionnel. Afin d’intégrer l’analyse TCR répertoire des séquences avec des essais fonctionnels de TCR, les approches de séquençage devraient être conçus pour être compatible avec les systèmes expérimentaux et in vivo des modèles utilisés pour l’analyse fonctionnelle de select TCRs. Nous avons développé une approche efficace pour l’isolation de séquence humaine TCR et rationalisé sous clonage dans un vecteur de modèle des TCR de chimérique humain/souris compatible avec l’expression de TCR à souris humanisée HLA4. L’isolement des correspondants des chaînes alpha et bêta des hétérodimères TCRs nécessite l’amplification PCR des deux chaînes d’une seule cellule. Bien que plusieurs protocoles de clonage TCR unicellulaires ont été développés et utilisés, aucun jusqu’à présent ont été facilement compatible avec haut débit simplifiée clonage direct de TCRs Vα/Vβ inconnu dans des vecteurs rétrovirus nécessaires pour réexpression in vivo 4,5,6,7. Des études antérieures ont utilisé deux approches majeures, soit pour amplifier sélectivement une partie limitée du TCR suffit d’extrapoler la séquence, ou d’amplifier les TCR toute séquence4,5,6 , 7. analyse fonctionnelle en aval de TCR séquences obtenues par l’intermédiaire de la première approche exige la construction du TCR Assemblée et de novo coûteux en silico . Tandis que la seconde approche présente également la séquence complète de TCR, la région constante humaine n’est pas compatible avec in vivo l’expression des TCRs clonés dans des modèles murins. Notre approche est spécifiquement conçu pour être compatible avec in vivo analyse fonctionnelle des TCRs dans des modèles murins. Nous avons développé une cellule unique protocole PCR permettant directement sous clonage de fragments PCR dans le vecteur d’expression de modèle efficace et simplifiée.
Notre approche utilise une réaction de PCR de multiplex imbriqué très sensible qui s’effectue en deux étapes. Dans la première réaction de multiplexe étape une piscine de 40 amorces spécifiques pour toutes les chaînes de V-bêta et une piscine de 44 amorces spécifiques pour toutes les chaînes alpha-V sont utilisées pour amplifier la TCR-alpha ou bêta-TCR sans la connaissance préalable de la séquence (tableau 1). L’apprêt avant a une séquence de l’adaptateur, qui est incorporée dans la 5′ du produit PCR. L’apprêt inverse est issu de la région constante du TCR. Nous avons identifié des sites de restriction uniques qui sont absents de la variable humaine ou jonction TCR régions et incorporés dans des amorces nouvellement redessinés de TCRα et TCRβ (Figure 1). Dans la deuxième réaction imbriquée, une amorce spécifique pour la séquence de l’adaptateur et une amorce inverse imbriquée au sein de la région constante sont utilisés pour amplifier encore les chaînes TCR avec une spécificité accrue (tableau 1, Figure 1). Après l’isolement de cellules du même, deux rondes de PCR (première réaction avec un pool d’amorces Vα tant Vβ et deuxièmement avec des amorces adaptateur) aboutir à un produit PCR qui peut être directement sous cloné dans le template vecteur rétroviral. La construction TCR finale doit pouvoir coder, dans un cadre de lecture seule (ORF), les régions variables humaines combinées avec les régions constantes souris reliées par la séquence protéique « Self clivage », P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. La séquence de P2A a été utilisée dans plusieurs systèmes et a été longuement testée spécifiquement pour l’expression de TCRs8,9,10,11. Bien que, après traduction la plupart de la P2A séquence reste attachée à l’extrémité C-terminale de la chaîne alpha, reliée par un flexible linker, tandis que la séquence de signaux de chaîne bêta a une proline supplémentaire, cette modification n’a aucun effet néfaste sur la fonction TCR. La région constante de la souris est utilisée dans la construction au lieu de l’homme pour éviter des interactions altérées avec des composants de signalisation en aval lors de ré-exprimé dans les cellules de souris. L’ORF unique entraînera stoechiométrique expression distincte d’alpha et bêta chaînes9,11. Le protocole actuel est issu des réactifs et des approches qui sont largement disponibles et est conçu pour être réalisées de manière simple et efficace. Bien que nous avons spécifiquement utilisé cette technique pour dosage de TCRs des cellules T autoréactives impliqués dans le diabète auto-immun, nous prévoyons que ce protocole peut être largement applicable pour l’identification et l’évaluation fonctionnelle des TCRs humaines spécifiques pour épitopes auto-immunes, cancer épitopes ou réponses aux pathogènes et aux vaccins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le protocole actuel, nous décrivons une méthode efficace pour l’amplification de TCR unicellulaire et ultérieures sous clonage des chaînes appariées de TCR alpha et bêta dans un vecteur rétroviral expression de modèle. Bien que plusieurs protocoles PCR de cellule unique ont été développés, aucun jusqu’à présent ont été compatible avec immédiate sous clonage dans un vecteur d’expression. Dans la plupart des cas, une séquence partielle qui englobe les régions CDR3 très variables est amplifiée,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la FRDJ 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ et The Robert et Janice McNair Foundation.
Nous remercions Sandra Pena et Andrene McDonald pour le recrutement de patients, Samuel Blum pour l’assistance technique, le Dr George Makedonas pour le don d’anticorps et contrôle ADN utilisé pour l’optimisation de la PCR.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
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