Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs
Summary
Das aktuelle Protokoll kombiniert, die einzelne Zelle menschlichen TCR Alpha- und Beta-Kette Sequenzierung mit gepaart gestrafft Generation kompatibel mit in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck retroviralen Vektoren.
Abstract
Obwohl mehrere Methoden für die Sequenzierung von gepaarten T-Zell-Rezeptor (TCR) Alpha- und Beta-Ketten aus einzelnen T-Zellen entwickelt wurden, wurden keine bisher förderlich für nachgeschaltete in Vivo Funktionsanalyse des TCR Heterodimere. Wir haben eine verbesserte Protokoll basiert auf einem zweistufigen Multiplex nested PCR, resultiert in einer PCR-Produkt, das gesamte Variable Regionen eine menschliche TCR-Alpha und Beta-Ketten umfasst entwickelt. Durch die einzigartige Restriktionsschnittstellen Identifizierung und Einbindung in die PCR-Primer, haben wir das PCR-Produkt mit direkten vor-Klonen in der Vorlage retroviral Vektor kompatibel gemacht. Das daraus resultierende retrovirale Konstrukt kodiert eine Chimäre Mensch/Maus TCR mit einer Maus intrazelluläre Domäne in Mauszellen oder in Vivo Maus-Modellen funktioniert. Insgesamt verbindet das Protokoll hier beschriebenen menschlichen Einzelzelle gepaart TCR Alpha- und Beta-Kette Identifikation mit optimierten Generation von retroviralen Vektoren leicht anpassbar für in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck. Das Video und das Begleitmaterial sollen eine sehr detaillierte Beschreibung der einzelnen Zelle PCR, vermitteln, dass die entscheidenden Schritte gefolgt und mögliche Fallstricke vermieden werden können. Darüber hinaus bieten wir eine ausführliche Beschreibung der Klonen Schritte notwendig, um dem Expressionsvektor erzeugen. Sobald Sie beherrscht, konnte die ganze Prozedur von Einzelzelle Sortierung TCR Ausdruck in einem kurzen Zeitraum von zwei Wochen durchgeführt werden.
Introduction
Der T-Zell-Rezeptor (TCR) schreibt T-Zell-Schicksal-Entscheidung während der Entwicklung, Steady-State/Homöostase und Antigenen Stimulation in der Peripherie1,2,3. Jüngste Erweiterung der Deep sequencing Technologien hat eine bisher unterschätzte TCR Vielfalt in Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten aufgedeckt. TCR Vielfalt schlägt ein Potenzial für funktional Breite T-Zell-Reaktionen. Um die Sequenzanalyse Repertoire TCR TCR funktionale Tests zu integrieren, sollten die Sequenzierung Ansätze entworfen werden, kompatibel mit experimentellen Systemen und in Vivo Modelle für nachfolgende Funktionsanalyse der SELECT-Anweisung verwendet werden TCR. Wir haben einen effizienten Ansatz für menschliche TCR Sequenz Isolation entwickelt und gestrafft, vor-Klonen in einen Chimären Mensch/Maus TCR Vorlage Vektor mit TCR Ausdruck in HLA-humanisierten Mäuse4kompatibel. Isolation der entsprechenden Alpha- und Beta-Ketten des heterodimerisierenden TCR verlangt PCR Verstärkung der beiden Ketten aus einer einzigen Zelle. Obwohl einige einzellige TCR Klonen Protokolle entwickelt und genutzt haben, wurden keiner bisher problemlos kompatibel mit Hochdurchsatz-optimierte direkte Klonen unbekannter Vα/Vβ TCRs in retrovirale Vektoren für erneuten Ausdruck in-vivo notwendig 4,5,6,7. Frühere Studien haben zwei Hauptansätze, entweder um einen begrenzten Teil des TCR ausreichend, um die Sequenz zu extrapolieren oder verstärken die gesamte TCR Sequenz4,5,6 selektiv zu verstärken genutzt. , 7. Downstream Funktionsanalyse des TCR Sequenzen erhalten über den ersten Ansatz erfordert kostspielige in Silico Montage und de Novo Bau TCR. Während der zweite Ansatz die komplette TCR-Sequenz bietet, ist die menschliche konstante Region nicht in Vivo Ausdruck der geklonten TCRs in Mausmodellen vereinbar. Unser Ansatz ist speziell mit in Vivo Funktionsanalyse des TCR in Maus-Modellen kompatibel. Wir entwickelten eine effiziente und schlanke einzelligen PCR-Protokoll, das für direkte vor-Klonen der PCR-Fragmente in der Vorlage Expressionsvektor ermöglicht.
Unser Ansatz nutzt eine hochsensible Multiplex verschachtelten PCR-Reaktion, die in zwei Schritten durchgeführt wird. In der ersten Multiplex-Reaktion Schritt einen Pool von 40 Primer speziell für die V-Beta-Ketten und einen Pool von 44 Primer speziell für alles, was die V-Alpha-Ketten verwendet werden, um die TCR-Alpha oder TCR-Beta ohne Vorkenntnisse der Sequenz (Tabelle 1) zu verstärken. Der forward Primer hat eine Adapter-Sequenz, die in der 5′ des PCR Produktes aufgenommen wird. Die rückwärts-Primer basiert auf die konstante Region der TCR. Wir haben ermittelt, einzigartige Restriktionsschnittstellen, die aus menschlichen Variable oder Kreuzung TCR Regionen fehlen, und integriert diese in neu gestalteten TCRα und TCRβ Primern (Abbildung 1). In der zweiten verschachtelte Reaktion eine Grundierung, die spezifisch für die Adapter-Sequenz und einer verschachtelten rückwärts-Primer in der konstanten Region dienen weiter verstärken die TCR-Ketten mit erhöhte Spezifität (Tabelle 1, Abb. 1). Nach einzelnen Zelle isoliert, zwei Runden der PCR (erste Reaktion mit einem Pool von Vα und Vβ Primern, und zweitens mit Adapter Primern) führen ein PCR-Produkt, das direkt in die Vorlage retroviral Vektor Sub geklont werden kann. Das endgültige TCR-Konstrukt wird in eine einzelne offene Leserahmen (ORF), menschlichen Variablen Regionen kombiniert mit Maus konstante Regionen durch die “Self anhaftenden” Proteinsequenz verbunden kodieren P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. Der P2A-Sequenz wurde in mehreren Systemen eingesetzt und wurde speziell für den Ausdruck von TCR8,9,10,11ausgiebig getestet. Obwohl, nach Übersetzung P2A Sequenz bleibt der Großteil an dem C-Terminus der alpha-Kette durch eine flexible Linker verbunden, während der Beta-Kette Signalsequenz eine zusätzliche Prolin, diese Änderung hat hat keine nachteiligen Auswirkungen auf die TCR-Funktion. Die konstante Region der Maus wird in das Konstrukt statt Menschen verwendet, um mögliche veränderte Interaktionen mit nachgeschalteten Signalisierung Komponenten zu vermeiden wenn wieder in Mauszellen exprimiert. Die einzige ORF führen stöchiometrische separater Ausdruck von Alpha- und Beta-Ketten9,11. Das aktuelle Protokoll basiert auf Reagenzien und Ansätze, die überall erhältlich sind, und soll in einer schlanken und effizienten Art und Weise durchgeführt werden. Obwohl wir diese Technik speziell zur TCR von selbstzersetzliche T-Zellen in autoimmune Diabetes verwickelt assay verwendet haben, erwarten wir, dass dieses Protokoll allgemein anwendbar zur Identifizierung und funktionelle Beurteilung menschlichen TCRs spezifisch für sind autoimmune Epitope, Krebs Epitope oder Reaktionen auf Krankheitserreger und Impfstoffe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das aktuelle Protokoll beschreibt eine effiziente Methode für einzelne Zelle TCR Verstärkung und nachfolgende vor-Klonen von gekoppelten TCR-Alpha und Beta-Ketten in eine Vorlage retrovirale Expressionsvektor. Obwohl mehrere einzelne Zelle PCR Protokolle entwickelt wurden, haben keine kompatibel mit sofortiger vor-Klonen in einem Ausdruck Vektor bisher. In den meisten Fällen wird eine Teilsequenz der hochvariablen CDR3 Regionen verstärkt, mit genügend Sequenz, die Variable Region zu extrapolieren. Dieser kleiner PCR…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30-DK079638-05-PILOT PJ, and The Robert und Janice McNair Foundation finanziert.
Wir danken Sandra Pena und Andrene McDonald für Rekrutierung von Patienten, Samuel Blum für technische Hilfe, Dr. George Makedonas für die Gabe von Antikörpern und Kontrolle DNA für die PCR Optimierung verwendet.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
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