合理化単細胞 TCR 分離し体外の Retroviral ベクトルの生成、人間 Tcr の生体内で発現
Summary
単一のセル対人間 TCR アルファとベータ鎖シーケンスで現在のプロトコル結合合理化レトロウイルスベクターの in vitroとin vivoの TCR 式と互換性の世代です。
Abstract
1 つの T 細胞からペアの T 細胞受容体 (TCR) アルファとベータ鎖の配列のためのいくつかの方法が開発されているが、どれもはこれまで TCR ヘテロの下流に資する生体内機能解析をされています。人間の TCR アルファとベータ鎖の可変領域を全体にまたがる PCR の製品の結果を持つ多重ネストの 2 段階 PCR に基づく改良されたプロトコルを開発しました。ユニークな制限のサイトを識別し、PCR のプライマーに組み込む、によって行った PCR の製品テンプレート レトロウイルスベクターに直接補助的クローニングと互換性があります。結果としてレトロ ウイルス構築キメラ人間/TCR を持つマウス マウス細胞やマウスモデルの生体内での機能はマウスの細胞内ドメインをエンコードします。全体的に、ここで説明されているプロトコルは生体外でそして生体内の TCR 式のレトロウイルスベクター容易に適応できるの合理化された世代対単一細胞 TCR アルファとベータ チェーン識別を組み合わせたものです。ビデオとそれに伴う材料は、重要なステップは続くと潜在的な落とし穴を回避できるように、単一セル PCR の非常に詳細な説明を与えるに設計されています。また、発現ベクターを生成に必要なクローン作成の手順の詳細な説明を提供します。一度マスター、TCR 式に並べ替え 1 つのセルから全体の手順は 2 週間の短期間で実行でした。
Introduction
T 細胞受容体 (TCR) は、開発、定常状態/恒常性やその周囲1,2,3の抗原的な刺激の中に T 細胞の運命の決定を決定します。深い技術の最近の展開は、抗原特異的 T 細胞応答内以前過小評価 TCR の多様性を発見しました。TCR の多様性では、機能的な T 細胞の反応の可能性を示唆しています。実験的システムと生体内でのモデル選択の後続機能解析のために利用に対応する TCR 機能アッセイと TCR シーケンス レパートリー解析を統合するためにシーケンスのアプローチを設計する必要があります。Tcr。人間の TCR シーケンスの分離のための効率的な方法を開発し、HLA ヒト化マウス4TCR 式と互換性のあるキメラマウス人間 TCR テンプレートのベクターへのクローニングはサブを合理化します。ヘテロ二量体型 Tcr の対応するアルファとベータ鎖の分離には、単一のセルから両方の鎖の PCR 増幅が必要です。とはいえ、いくつかの単一セル TCR のクローニング プロトコルが開発され利用どれもこれまでのところされている高スループット合理化された直接クローニングによる未知の Vα/Vβ Tcr の retroviral ベクトル再式の生体内での必要に簡単に互換性のあります。 4,5,6,7。以前の研究は、シーケンスを外挿法で推定したり、全体 TCR シーケンス4,5,6を増幅するための十分な TCR の限られた部分を選択的に増幅する 2 つの主要なアプローチを活用して,7します。 最初のアプローチを介して TCR 系列の下流の機能解析が必要です高価なインシリコアセンブリおよびde novoの建設、TCR。2 番目のアプローチでは、TCR の完全な配列を提供しています、人間の一定の領域はマウス モデルでクローンの Tcr の体内式と互換性ありません。我々 のアプローチは生体内機能解析 Tcr のマウスのモデルに対応する設計します。我々 は、効率的で合理化された単一電池直接補助的クローニング PCR のフラグメントのテンプレートの発現ベクターには、PCR のプロトコルを開発しました。
我々 のアプローチは、2 つの手順で実行される高感度多重入れ子に PCR 反応を利用しています。最初の多重反応 40 プライマーすべての V β 鎖の特定のプールと 44 プライマー シーケンス (表 1) の事前知識がなくて TCR アルファまたは TCR β を増幅するための V α 鎖すべての特定のプールをステップします。前方のプライマーが 5′ の PCR の製品に組み込まれているアダプターのシーケンスです。逆のプライマーは、TCR の一定した領域に基づいています。もとは、ユニークな制限のサイト人間変数またはジャンクション TCR 地域から欠席し、新しく再設計された TCRα と TCRβ のプライマー (図 1) にこれらを組み込みます。2 番目の入れ子になった反応アダプター シーケンスの特定のプライマーおよび一定した領域内で入れ子になった逆プライマーを使用して高められた特定性 (表 1、図 1) と TCR チェーンをさらに増幅します。単一細胞の分離後、2 つの PCR のラウンド (Vα と Vβ の両方のプライマーのプールと 2 番目アダプター プライマーの最初の反応) 直接補助的クローン作成できるテンプレート retroviral ベクトルに PCR の製品の結果します。1 つのオープンリーディング フレーム (ORF)、’自己切断’ 蛋白質シーケンスによって接続されているマウスの一定領域と組み合わせて人間の可変領域で、TCR の最終的な構成要素をエンコード P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8。P2A シーケンスは、複数のシステムで使用されている、Tcr8,9,10,11の表現のために具体的には広範囲にテストされています。とはいえ、P2A シーケンスの残物のほとんどに接続されている後の翻訳ベータ鎖信号シーケンスが追加プロリン、この変更適用範囲が広いリンカーによって接続されているアルファ鎖の C 末端に TCR 機能に有害な影響がないです。マウスの一定の領域が下流のシグナル伝達コンポーネント潜在的な変更された相互作用を避けるために人間ではなく構成要素で使用が場合再マウスの細胞で発現します。単一 ORF は、アルファおよびベータ鎖9,11の化学量論的個別式になります。現在のプロトコルは試薬および広く利用可能、アプローチに基づいており、合理的で効率的な方法で実行するように設計。このプロトコルは同定と人間 Tcr の特定の機能評価に広く適用することができますが、特に自己免疫性糖尿病に関与する自己反応性 T 細胞の Tcr を試金するこのテクニックを使いました、見込んでください。自己免疫性エピトープ、がん抗原や病原体とワクチンへの応答。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在のプロトコルの単一セルの TCR 増幅特性とそれに続く補助的クローニング ペアの TCR アルファとベータ鎖のテンプレート レトロ ウイルス発現ベクターに効率的な方法をについて説明します。単一セル PCR のいくつかのプロトコルが開発されているが、どれもはこれまで即時サブ表現のベクトルへのクローニングと互換性があるされています。ほとんどの場合、可変領域を推定する十分な?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、JDRF 1-FAC-2014-243-A-N、ADA 7-14-ユニデン-07、NIH 5 P30 DK079638 05 パイロット PJ と、ロバートとジャニス ・ マクネイア財団によって賄われていた。
患者の募集、テクニカル サポート、博士ジョージ Makedonas 抗体とコントロール PCR の最適化に使用される DNA のギフトのためにサミュエル ・ ブラム、サンドラ ペーニャと Andrene マクドナルドに感謝します。
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
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