Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas
Summary
O atual combina de protocolo único celular emparelhado humana TCR alfa e beta cadeia sequenciamento com simplificada geração de vetores retrovirais compatíveis com expressão de TCR in vitro e in vivo .
Abstract
Embora, desenvolveram-se vários métodos de sequenciamento de emparelhados T cell receptor (TCR) alfa e beta cadeias de células T únicas, nenhum até agora têm sido propício à jusante na vivo análise funcional de TCR heterodímeros. Nós desenvolvemos um protocolo melhorado baseado em um Two-Step aninhada multiplex PCR, o que resulta em um produto PCR que abrange regiões inteiras de variável de um humano TCR alfa e beta cadeias. Identificando locais da limitação original e incorporando-os aos primers PCR, fizemos o produto do PCR compatível com sub clonagem direto para o vetor retroviral do modelo. A construção resultante retroviral codifica um quimérico humano/mouse TCR com um domínio intracelular do mouse, que é funcional em células de rato ou em modelos de rato na vivo . No geral, o protocolo descrito aqui combina humana única célula emparelhada TCR alfa e beta cadeia identificação com geração simplificada de vetores retrovirais facilmente adaptávelas para expressão de TCR in vitro e in vivo . O vídeo e o material que acompanha são projetados para dar uma descrição minuciosa da única célula PCR, para que os passos críticos podem ser seguidas e potenciais armadilhas evitadas. Além disso, nós fornecemos uma descrição detalhada das etapas necessárias para gerar o vetor de expressão clonagem. Uma vez dominado, todo o processo de célula única classificação a expressão TCR poderia ser realizado em um curto período de duas semanas.
Introduction
O receptor de células T (TCR) dita decisão de destino T celular durante o desenvolvimento, estado estacionário/homeostase e estimulação antigênica na periferia1,2,3. Recente expansão de tecnologias de sequenciamento de profundidade descobriu uma diversidade TCR subvalorizada anteriormente dentro respostas de célula T específica do antígeno. Diversidade TCR sugere um potencial de respostas funcionalmente amplo de célula T. Para integrar a análise de repertório do TCR sequência com ensaios funcionais de TCR, as abordagens de sequenciamento devem ser projetadas para ser compatível com sistemas experimentais e na vivo modelos utilizados para posterior análise funcional de select TCRs. Desenvolvemos uma abordagem eficiente para o isolamento de sequência humana TCR e racionalizado sub clonagem em um vetor de modelo TCR quimérico humano/rato compatível com expressão de TCR em ratos HLA-humanizado4. Isolamento das correspondentes cadeias alfa e beta de heterodimérica TCRs requer amplificação por PCR de ambas as correntes de uma única célula. Apesar de vários protocolos TCR da célula única clonagem foram desenvolvidos e utilizados, nenhum até agora foram facilmente compatível com elevado-throughput simplificada clonagem direto do desconhecido Vα/Vβ TCRs em vetores retrovirais necessárias para re-expressão in vivo 4,5,6,7. Estudos anteriores já utilizaram duas abordagens principais, tanto para amplificar seletivamente uma parte limitada da TCR suficiente para extrapolar a sequência, ou amplificar a sequência TCR inteira4,5,6 , 7. análise funcional a jusante das sequências TCR, obtidos através da primeira abordagem requer dispendiosos em silico montagem e novo de construção da TCR. Enquanto a segunda abordagem fornece a sequência completa de TCR, região constante humana não é compatível com expressão na vivo das TCRs clonados em modelos do rato. Nossa abordagem é especificamente projetada para ser compatível na vivo análise funcional de TCRs em modelos do rato. Desenvolvemos uma única célula simplificada e eficiente protocolo PCR que permite o sub clonagem direto de fragmentos do PCR em vetor de expressão do modelo.
Nossa abordagem utiliza uma altamente sensível aninhada multiplex PCR reação é executada em duas etapas. Na primeira reação de multiplex passo uma de 40 primers específicos para todas as cadeias de V-beta e uma piscina de 44 primers específicos para todas as cadeias de V-Alfa são usadas para amplificar o TCR-alfa ou beta-TCR sem o conhecimento prévio da sequência (tabela 1). O primer para a frente tem uma sequência de adaptador, que é incorporada a 5′ do produto do PCR. O primer reverso baseia-se na região constante da TCR. Nós identificamos sites única restrição que são ausentes de variável humana ou junção TCR regiões e incorporada no redesenhado TCRα e TCRβ primers (Figura 1). Na segunda reação aninhada, um primer específico para a sequência de adaptador e um primer reverso aninhado dentro da região constante são usados para amplificar ainda mais as cadeias TCR com maior especificidade (tabela 1, Figura 1). Após o isolamento de célula única, duas rodadas de PCR (reação de primeira com uma piscina de primers tanto Vα e Vβ e a segunda com primers adaptador) resultam em um produto PCR que pode diretamente ser sub clonado no vetor retroviral modelo. Construção de TCR final irá codificar, em uma moldura única leitura aberta (ORF), regiões variáveis humanas, combinadas com regiões de constante do mouse conectadas pela ‘self chicotada’ sequência de proteína, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. A sequência de P2A tem sido usada em vários sistemas e foi extensivamente testada especificamente para a expressão de TCRs8,9,10,11. Embora, após tradução, a maioria dos restos sequência P2A anexada ao C-terminal da cadeia alfa, conectado por um vinculador flexível, enquanto a sequência de sinal de cadeia beta tem uma prolina adicional, esta alteração não tem nenhum efeito prejudicial na função TCR. A região constante do mouse é usada na construção em vez de humanos para evitar potenciais interações alteradas com componentes de sinalização downstream quando re-expressa em células de rato. O único ORF irá resultar em estequiométrico expressão separada da de9,de cadeias alfa e beta11. O protocolo atual é baseado em reagentes e abordagens que estão amplamente disponíveis e é projetado para ser executada de maneira otimizada e eficiente. Embora especificamente usamos essa técnica para ensaiar TCRs de células T auto-reativas implicadas na diabetes auto-imune, prevemos que este protocolo pode ser amplamente aplicável para identificação e avaliação funcional de humanos TCRs específicos para epítopos auto-imunes, câncer epítopos ou respostas a patógenos e vacinas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo atual, descrevemos um método eficiente para amplificação de TCR unicelulares e subsequente sub clonagem de cadeias de alfa e beta TCR emparelhadas em um vetor retroviral expressão do modelo. Embora, desenvolveram-se vários protocolos PCR de célula única, nenhum até agora têm sido compatíveis com imediata sub clonagem em um vetor de expressão. Na maioria dos casos, uma sequência parcial, englobando as regiões CDR3 altamente variáveis é amplificada, com suficiente sequência de extrapolar a regi?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado pelo 1-FAC-2014-243-A-N JDRF, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 piloto PJ e o Robert e Janice McNair Foundation.
Agradecemos a Sandra Pena e Andrene McDonald para o recrutamento de paciente, Samuel Blum para assistência técnica, Dr. George Makedonas pelo dom de controle usado para otimização de PCR de DNA e anticorpos.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
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