Når fjernes fra kroppen, er neuronalt væv stærkt påvirket af miljømæssige forhold, der fører til eventuel nedbrydning af vævet efter 6 – 8 timer. Ved hjælp af en unik inkubation fremgangsmåde, som nøje overvåger og regulerer det ekstracellulære miljø af vævet, kan vævslevedygtighed blive udvidet betydeligt i> 24 timer.
Akut neuronale væv præparater, hjerne skiver og retinal wholemount, kan normalt kun opretholdes i 6 – 8 timer efter dissektion. Dette begrænser den eksperimentelle tid, og øger antallet af dyr, der er brugt per undersøgelse. Denne begrænsning specifikt påvirkninger protokoller såsom calcium imaging, der kræver langvarig præ-inkubering med bad-anvendte farvestoffer. Eksponentiel bakterievækst inden for 3 – 4 timer efter slicing tæt korreleret med et fald i væv sundhed. Denne undersøgelse beskriver en fremgangsmåde til at begrænse antallet af bakterier i akutte præparater for at opretholde levedygtige nervevæv i længere tid (> 24 h) uden behov for antibiotika, sterile procedurer, eller vævskultur medier indeholdende vækstfaktorer. Ved at cykle den ekstracellulære væske gennem UV-bestråling og holde vævet i en brugerdefineret bedrift kammer ved 15 – 16 ° C vævet viser ingen forskel i elektrofysiologiske egenskaber eller calcium signaling gennem intracellulære calcium farvestoffer ved> 24 timer postdissection. Disse metoder vil ikke kun forlænge eksperimentel tid for dem ved hjælp akut nervevæv, men vil reducere antallet af dyr, der kræves for at fuldføre eksperimentelle mål, og vil sætte en guld standard for akut neuronalt væv inkubation.
Elektrofysiologi og funktionel billeddannelse (calcium, spænding følsomme farvestoffer) er to af de mest almindeligt anvendte eksperimentelle teknikker i Neuroscience. Brain slice præparater og retinal wholemount, som vil blive behandlet her, er et middel til at undersøge elektrofysiologiske egenskaber og synaptisk konnektivitet uden forurening fra anæstetika eller muskelrelaksantia. Hjerneskiver og retinal wholemount bevare deres strukturelle integritet, i modsætning kulturer eller cellehomogenater, tillader undersøgelsen af særlige kredsløb og hjernenetværk 1. Optagelser fra isolerede væv har fordele i forhold til in vivo optagelser, da bevægelser forbundet med hjerteslag og respiration er elimineret. Desuden direkte visualisering giver specifikke klasser af celler, der skal målrettet og lokal anvendelse af farmakologiske værktøjer 2, 3.
Patch-clamp optagelser og calcium farvestof-belastning i retinal wholemount kompliceres af eksistensen af Inner Begrænsning Membrane (ILM), som dækker Retinal ganglieceller (RGC) lag og forhindrer direkte adgang til cellerne. Typisk er denne membran skrabes væk med en glaspipette til at tillade direkte anvendelse af et plaster pipette og dannelse af en gigaohm forseglingen på en enkelt celle. Hertil kommer, at bad påført calcium farvestoffer ikke krydse ILM og skal enten injiceres under denne membran 4, retrogradt transporteres efter injektion på synsnerven 5 eller elektroporeret gennem vævet 6. Endvidere, når anvendelse af en gnaver-model af retinitis pigmentosa, rd / rd mus, ILM er tykkere og mere uigennemtrængelig. Her bruger vi en teknik til at fjerne ILM med enzymatisk fordøjelse 7, at give både allestedsnærværende calcium farvestof-belastning, og direkte adgang til retinale ganglieceller til patch-clamp RECORDINGS 8.
Succesfulde optagelser fra enten hjernen skiver eller retinal wholemount afhænger dissektion og inkubering af levedygtigt neuronalt væv. Typisk væv ekstraheres om morgenen for eksperimentet og inkuberet i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), indtil det anvendes til optagelser. Normalt væv forbliver levedygtige i 6 – 8 timer, med betydelig nedbrydning følger denne tidsvindue. Men begge hjerneskiver og wholemount retinae præparater normalt producerer mere væv end der kan optages inde fra denne korte tidsperiode. Derfor bliver vævet ofte kasseret i slutningen af dagen og dissektion afsluttes igen på de efterfølgende dage. Det betyder et andet dyr anvendes, og ~ 2 timers opsætning og dissektion / farvning gentaget. Følgende protokol beskriver en fremgangsmåde til at forlænge levetiden af neuronvæv i mere end 24 timer, hvilket betyder færre dyr anvendes, og mere eksperimentelle tid til rådighed. Tissue levedygtighed wsom vurderet gennem optagelse af elektrofysiologiske egenskaber og calcium dynamik, og disse egenskaber var ikke skelnes mellem <4 timer og> 24 timer postdissection.
Disse resultater viser, at ikke alene er encellede egenskaber intakt og funktionel efter forlænget inkubation, men netværksaktivitet, som vurderet ved calcium-billedbehandling og elektrofysiologiske optagelser, er uændret> 24 timer postdissection. Endvidere viser vi, at calcium farvestoffer kan forblive i celler i længere perioder uden at forårsage nogen skadelige virkninger. Anvendelsen af denne protokol viser, at den funktionelle aktivitet af neuroner i akut neuronal væv kan opretholdes i lange perioder, når det eksterne miljø er stærkt reguleret. Da levedygtighed væv varierer meget mellem laboratorier på grund af forskellige inkubation protokoller, denne metode etablerer en guld standard for de ideelle parametre, der skal anvendes til at reducere variation i sundhed akut neuronal væv.
Denne artikel beskriver en inkubation metode til at forlænge holdbarheden af akut neuronal væv til billedbehandling og elektrofysiologiske eksperimenter og dermed reducere de antallet af dyr, der er nødvendige for at gennemføre eksperimentelle mål. To vigtige processer regulerer forringelse af neuronal væv over tid: i) øget bakterier niveauer, og den ledsagende stigning i bakteriel endotoksin frigivet, og ii) excitotoksicitet som følger den traumatiske udskæring procedure 10. Som a…
The authors have nothing to disclose.
We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).
Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
CCD Camera | Andor | Ixon + | |
High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |