Hälsotillståndet hos lungan reflekteras av typen och antalet immunceller som finns i bronkioler i lungan. Vi beskriver en bronkoalveolär skölj teknik som tillåter isoleringen och studie av icke-adherenta celler och lösliga faktorer från de nedre luftvägarna hos möss.
Bronkoalveolär sköljning (BAL) är en experimentell procedur som används för att undersöka den cellulära och acellulära innehållet i lunglumen ex vivo för att få insikt i en pågående sjukdomstillstånd.
Här är en enkel och effektiv metod som beskrivs för att utföra BAL på murina lungor utan behov av speciella verktyg eller utrustning. BAL-vätskan isoleras genom införande av en kateter i luftstrupen av terminalt sövda möss, genom vilka en saltlösning instilleras in i bronkiolerna. Den instillerade fluiden försiktigt tillbaka för att maximera BAL-vätskan hämtning och för att minimera skjuvkrafter. Denna teknik tillåter viabiliteten, funktion och struktur av celler i luftvägarna och BAL-vätskan som skall konserveras.
Många tekniker kan tillämpas för att få ytterligare förståelse för sjukdomstillståndet hos lungan. Här, är en ofta använd teknik för identifiering och räkning av olika typer av immuncellerBeskrivet, där flödescytometri kombineras med en selektionspanel av fluorescensmärkta cellytspecifika markörer. BAL-proceduren som presenteras här kan också användas för att analysera smittämnen, vätskekomponenter eller inandade partiklar i murina lungor.
Luftvägarna möter många förolämpningar, vilket kan leda till inflammation, patogen invasion eller malign transformation. Epitelceller som kantar lung lumen bildar ett av de största hindren i däggdjurskroppen. Tillsammans med alveolära makrofager, de förhindrar miljöhot från att få tillträde till den systemiska systemet via luftvägarna. Exempel på sådana hot innefattar organiska och oorganiska kemikalier, bakterier och virus. På samma sätt kan specifika vaccinationer eller terapeutiska ingrepp utformas för att rikta lungorna. I alla dessa fall är en utarbetad analys av den framkallade svaret viktigt att förstå, ingripa eller förebygga biologiska processer som sker inom andningsorganen.
Bronkoalveolär lavage (BAL) är ett ovärderligt metod för att analysera sådana svar, som de resulterande proverna innehåller viktig information om de inflammatoriska svar, immunmekanismer, och infektiös sjukdomsprogressionSom kan uppstå i lungluftvägarna 1 , 2 . Genom att använda BAL är det möjligt att studera de infiltrerande cellerna. Detta kontrasterar med uppmätta lungor, som ger en "smutsigare" cellpopulation, med många döda och klibbiga celler. BAL utförs genom att införa en saltlösning i terminalbronkolerna och därefter återvinna denna lösning. Den upptagna lösningen kan sedan användas för att kvantifiera och fenotypiskt analysera invändig lung och infiltrera inflammatoriska celler. Denna metod används ofta för att studera celltillströmning i sjukdomsmodeller av luftvägarna, såsom astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (COPD) och infektionssjukdomsmodeller. Bortsett från den cellulära kompositionen, reflekteras även den pulmonella luftvägarnas molekylära sammansättning i BAL-vätskan. För att analysera detta kan enzym-länkad immunosorbentanalys (ELISA), immunoblot och samtidig analys av multipla cytokiner av en cytokinpärla-grupp varaUtförs för att bedöma närvaron av cytokiner och kemokiner.
BAL är en väletablerad metod för att studera inflödet av inflammatoriska celler i inflammatoriska respiratoriska sjukdomsmodeller. Observationen av en förändrad cellulär tillströmning ( t.ex. ökade nivåer av lymfocyter, eosinofiler eller neutrofiler) kan leda till bättre insikt i sjukdomen och kan vara en objektiv parameter för att bedöma prestationen av en terapeutisk ingrepp.
Den exakta och reproducerbara tolkningen av BAL-cellanalys kräver att BAL utförs korrekt och att den uppsamlade vätskan hanteras och behandlas ordentligt. Begreppet "bronkialsköljning" introducerades för mer än 80 år sedan av Stitt 3 . År 1961 erhöll Myrvik alveolära makrofager från sköljvätskan av kaninlungor 3 . BAL är nu en vanlig metod för att analysera och övervaka lungorna i musmodellen, men ändåre är fortfarande ingen rapport om ett standardiserat BAL förfarande i den vetenskapliga litteraturen 4, 5. Dessutom finns det förmodligen lika många sätt att utföra BAL som det finns forskningslaboratorier som använder den teknik 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Det är viktigt att de uppgifter som erhålls från BAL representerar hela mus lunga och inte bara en del av lungan. Denna typ av variation försvårar tolkning och jämförelse av resultaten mellan olika studier.
Här, är en grundläggande, billig och reproducerbar BAL förfarandet beskrivet som tillåter insamling av den cellulära och lösliga fraktionen närvarande i luftvägslumen hos musen. Kort sagt, är en kateter placerad i den exponerade luftstrupen ofa terminalt sövd mus. En spruta är ansluten till katetern, och en buffrad saltlösning, som innehöll etylendiamintetraättiksyra (EDTA) införs i lungorna. De lunglumen samplas genom försiktig upprepad spolning av saltlösningen med användning av kolven. Det negativa trycket appliceras under detta steg är minimal för att förhindra luftvägskollaps. Efter insamling, bör den erhållna BAL behandlas ytterligare för att räkna upp och identifiera cellerna genom flödescytometri.
BAL är en användbar teknik för att få cytologisk och biokemisk information som svar på infektioner eller droger. Inledningsvis var BAL används för att hantera den överdrivna slem produktion i humana patienter som lider av fosgen toxicitet 3. Numera är den teknik som används på människor för att undersöka lung patogenes, diagnos och terapeutisk behandling av sjukdomar 3, 24. I laboratoriedjur, är BAL vanligen används för att övervaka inflammatoriska svar, immunmekanismer, och infektiösa sjukdomsprocesser som sker i de pulmonella luftvägarna 1, 2.
För att studera den inflammatoriska cellulärt mönster i respiratoriska sjukdomsmodeller, bör BAL följas av absolut och differentiell cellräkning. I tillägg till det absoluta cellantalet, de relativa cellantalet är också av intresse. Till exempel, reparation och cancermodeller visar vEry liten eller inget BAL cellantal ökar. I denna modell är bedömningen av cellkompositionen användbar. Genom att använda cellfärgning i kombination med ljusmikroskopi kan olika celltyper, såsom eosinofiler, neutrofiler, makrofager och lymfocyter identifieras baserat på morfologi 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Flödescytometri kan användas för specifika bedömningar, såsom att identifiera olika T-cellfenotyper 7 , 31 . Förutom identifieringen av de olika infiltrerande cellpopulationerna kan lungens icke-cellulära komposition undersökas med användning av BAL. Metoder såsom ELISA, immunoblott, cytokinpärramatris, immunohistokemi och kvantitativ polymeraskedjereaktion utförs på BAL-fluid för bestämning av cytokiner, tillväxtfaktorer och andra inflammatoriska komponenter. För att bestämma lungskador, kan totala protein- och laktatdehydrogenas nivåer i BAL-vätskan också mätas 32, 33.
Med utvecklingen av nya diagnostiska verktyg, kommer iska och proteomik karakterisering av BAL komponenter vara möjligt inom en snar framtid. Kombinationen av expanderande beräkningskapacitet och hög genomströmning genuttryck teknik kommer att göra det möjligt att definiera specifika gen-expressionsprofiler för olika sjukdomstillstånd. Utföra dessa tekniker på BAL-vätskan kan ge gen- och proteinuttrycksmönster för att identifiera de viktiga molekyler som är involverade i de olika faserna av lungsjukdomar.
Den största begränsningen av data erhållna från BAL-vätskan är bristen på jämförbarhet mellan olika forskningsförsök 3, 9. Det finns en hög grad avVariabilitet i spolteknik och efterföljande bearbetning av BAL-fluid. För att kunna jämföra varje BAL-försök är det nödvändigt att standardisera typen av avloppsvätska som instilleras, instillationsstället och den fraktion som ska analyseras för cellulär och icke-cellulär komposition. Det finns signifikanta skillnader i antalet bränslefraktioner mellan olika försök, varierande från en till 14 gånger 34 , 35 , 36 . Denna skillnad kan påverka det uppskattade totala antalet cellnummer i lungorna. Det är viktigt att veta vilken BAL-fluidfraktion som innehåller de flesta cellerna. Song et al. Visade att cirka 70% av det totala antalet celler hämtades i fraktion ett till tre 22 . Andra rapporter föreslog dock att den andra spolen innehöll fler celler än den första 37 , 38 </sup>. Vi kan dra slutsatsen från dessa studier att en lavage med bara en fraktion inte representerar hela lungan, vilket leder till misstolkning av resultaten.
Den ickecellulära sammansättning BAL vätskan innehåller värdefull information om hälsotillståndet hos lungan 33, 39, 40. Variationer i utspädningen av BAL-vätskan bidrar till skillnaden i kvantifieringen av den lösliga fraktionen och, följaktligen, till skillnader i resultat mellan studierna. Låten et al. jämfört proteinet och laktatdehydrogenas nivåer av varje sköljfraktionen och drog slutsatsen att den första sköljnings fraktionen innehöll två till tre gånger mer än den andra fraktionen.
För att hämta ett representativt BAL prov för analys, några tekniska överväganden är avgörande. En av dem är att utföra rätt bedövning. Det är mycket viktigt att kontrollera foten refLex av musen för att säkerställa terminal sedering. Detta är inte bara viktigt av etiska skäl, men också för att det är svårt att placera och behålla katetern i rätt läge om musen inte är ordentligt bedövad.
En andra viktig teknisk överväganden är kateterets position i luftröret. När kateteret sätts in för djupt kan det skada lungstrukturen. Kateterets distala ände bör inte nå lungorna under BAL-proceduren. Katetern bör också stabiliseras och binds med en bomullstråd. Om kateteret inte stabiliseras kan den injicerade saltlösningen strömma uppåt i näshålan istället för ner i lungorna. Under injektion och aspiration av saltlösningen är det viktigt att hålla katetern stadigt.
De data som erhållits från BAL-vätskan måste representera hela den murina lungen. Därför är det viktigt att införa en tillräcklig mängd saltlösningbuffert ( dvs.3 ml, uppdelade i 3 alikvoter av 1 ml vardera). Det finns inget linjärt samband mellan cellutbytet och BAL-vätskan utbyte. Det är viktigt att samla lösningen försiktigt medan massera bröstkorgen på musen. Om skjuvkrafter är för starka, kan viabiliteten, funktion och struktur av celler i luftvägarna och BAL-vätskan äventyras. Om aspire vätskan inte syns i sprutan, försiktigt flytta katetern djupare eller högre i luftstrupen.
Särskild anmälan bör ges till specifika aspekter av BAL bearbetning och analys. Detta kommer att maximera informationen behålls från BAL-prover. Efter BAL är cellerna i ett näringsfattigt koksaltmedium. Det är därför mycket viktigt att behandla proverna inom en timme efter BAL provtagning. Om långvarig lagring är nödvändig, krävs användningen av ett näringsämne-kompletterat medium.
Att bevara cellviabilitet, undvika rör som främjar cellvidhäftning till ytan. Undvik centrifugation av cellsuspensioner vid hastigheter som sannolikt kommer att äventyra cellulär integritet eller för att förhindra jämn resuspension av de hämtade BAL-celler. BAL-vätskan innehållande celler bör centrifugeras vid 400 xg och 4 ° C under 7 min. Det är viktigt att hålla i minnet att cellsuspensioner bör hållas vid 4 ° C under bearbetningen.
The authors have nothing to disclose.
LVH är forskningsassistent vid Institutionen för biomedicinsk molekylärbiologi vid Ghent University. ERJ stöds av UniVacFlu, bevilja nummer 607690. KR stöds av EC-FP7-projektet FLUNIVAC.
balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
flow cytometer | BD Biosciences | ||
catheter | BD Biosciences | 393202 |