फेफड़े के ब्रोन्कोइल में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रकार और संख्या द्वारा फेफड़ों की स्वास्थ्य स्थिति परिलक्षित होता है। हम एक ब्रोन्कोअलिवोलर लवेज तकनीक का वर्णन करते हैं जो चूहों के निचले श्वसन तंत्र से अलगाव और गैर-अनुपस्थित कोशिकाओं और घुलनशील कारकों के अध्ययन की अनुमति देता है।
ब्रोंकोवालविवेर लैज (बीएएल) एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया है जिसका उपयोग चल रहे बीमारी राज्य में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए फेफड़े लुमेन पूर्व विवो के सेल्यूलर और अकोशिक सामग्री की जांच करने के लिए किया जाता है।
यहां, विशेष उपकरण या उपकरण की आवश्यकता के बिना मुरिन फेफड़ों पर बीएएल करने के लिए एक सरल और कुशल पद्धति का वर्णन किया गया है। बालों के द्रव को अलग-अलग एनेस्थेटेड चूहों के ट्रेकिआ में एक कैथेटर डालने से अलग किया जाता है, जिसके माध्यम से एक खारा समाधान ब्रोन्कोइल में डाला जाता है। बाल द्रव की बहाली को अधिकतम करने और कवच बल को कम करने के लिए इन्स्ट्लाइड द्रव को धीरे-धीरे वापस ले लिया गया है। यह तकनीक संरक्षित होने के लिए वायुमार्ग और बाल द्रव के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता, कार्य और संरचना की अनुमति देता है।
फेफड़े की बीमारी की स्थिति को और समझने के लिए कई तकनीकों को लागू किया जा सकता है। यहां, विभिन्न प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान और गणना के लिए एक सामान्यतः इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक हैवर्णित है, जहां फ्लोसाइटमेट्री को फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सेल सतह-विशिष्ट मार्करों के एक चयन पैनल के साथ जोड़ा जाता है। यहां प्रस्तुत की गई बीएएल प्रक्रिया का उपयोग संक्रामक एजेंटों, तरल पदार्थों के घटकों या मूंह फेफड़ों के भीतर साँस कणों का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है।
वायुमार्ग कई अपमान, जो सूजन, रोगज़नक़ आक्रमण, या घातक परिवर्तन का कारण बन सकता मुठभेड़। उपकला कोशिकाओं है कि फेफड़े लुमेन लाइन स्तनधारी शरीर की प्रमुख बाधाएं में से एक के रूप में। साथ में वायुकोशीय मैक्रोफेज के साथ, वे वायुमार्ग के माध्यम से प्रणालीगत प्रणाली के लिए प्रवेश पाने से पर्यावरणीय खतरों को रोकने के। इस तरह के खतरों के उदाहरण कार्बनिक और अकार्बनिक रसायन, बैक्टीरिया और वायरस शामिल हैं। इसी तरह, विशिष्ट टीकाकरण या चिकित्सकीय हस्तक्षेप फेफड़ों को लक्षित करने के लिए डिजाइन किया जा सकता है। इन सभी मामलों में, पैदा की प्रतिक्रिया की एक विस्तृत विश्लेषण, समझ में हस्तक्षेप, या जैविक प्रक्रियाओं है कि श्वसन प्रणाली के भीतर जगह ले रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
ब्रोन्कोएल्वियोलर लेवेज (बाल), ऐसी प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के रूप में जिसके परिणामस्वरूप नमूने उत्तेजित प्रतिक्रियाएं, प्रतिरक्षा तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी वाली एक अमूल्य विधि, और संक्रामक रोग प्रगति हैकि फेफड़े के वायुमार्ग 1, 2 में हो सकता है। बाल का उपयोग करके, यह घुसपैठ कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए संभव है। यह पचा फेफड़े, यह है कि कई लोग मारे गए और चिपचिपा कोशिकाओं के साथ, एक "गंदी" सेल आबादी देने के विपरीत है। बाल टर्मिनल ब्रांकिओल्स में एक नमकीन घोल को शुरू करने और बाद में इस समाधान उबरने द्वारा किया जाता है। पुनः प्राप्त समाधान तो अंदाजा लगाना और phenotypically निवासी फेफड़ों और घुसपैठ भड़काऊ कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है। , क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी), और संक्रामक रोग मॉडल इस विधि अक्सर जैसे अस्थमा के रूप में वायुमार्ग की रोग मॉडल, में सेलुलर बाढ़ अध्ययन करने के लिए लागू किया जाता है। इसके अलावा सेलुलर संरचना से, फेफड़े के वायुमार्ग की आणविक संरचना भी बाल तरल पदार्थ में दिखाई देता है। इस विश्लेषण करने के लिए, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा), immunoblot, और साइटोकाइन मनका सरणी द्वारा कई साइटोकिन्स का एक साथ विश्लेषण किया जा सकता हैसाइटोकिन्स और chemokines की उपस्थिति का आकलन करने के प्रदर्शन किया।
बाल भड़काऊ सांस की बीमारी पशु मॉडल में भड़काऊ कोशिकाओं का तांता अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। एक परिवर्तित सेलुलर बाढ़ के अवलोकन (जैसे, लिम्फोसाइटों, इयोस्नोफिल्स, या न्यूट्रोफिल के स्तर में वृद्धि) रोग में बेहतर जानकारी मिल सकती है और एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप के प्रदर्शन का आकलन करने के उद्देश्य पैरामीटर हो सकता है।
बाल सेलुलर विश्लेषण के सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य व्याख्या की आवश्यकता है कि बाल सही ढंग से किया जाता है और एकत्र तरल पदार्थ संभाला और ठीक से संसाधित किया जाता है कि। शब्द "ब्रोन्कियल लेवेज" अस्सी से अधिक साल पहले स्टिट 3 द्वारा शुरू की गई थी। 1961 में, Myrvik खरगोश के फेफड़ों 3 की लेवेज तरल पदार्थ से वायुकोशीय मैक्रोफेज प्राप्त की। बाल अब विश्लेषण और माउस मॉडल में फेफड़ों की निगरानी के लिए एक अधिक इस्तेमाल किया विधि है, फिर भीफिर भी वैज्ञानिक साहित्य 4 , 5 में मानकीकृत बीएएल प्रक्रिया की कोई रिपोर्ट नहीं है। इसके अलावा, संभवतः बीएएल का प्रदर्शन करने के कई तरीके हैं क्योंकि तकनीक 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 का उपयोग करते हुए अनुसंधान प्रयोगशालाएं हैं। यह महत्वपूर्ण है कि बाल से प्राप्त आंकड़े पूरे मूरीन फेफड़े का प्रतिनिधित्व करते हैं, न केवल फेफड़े का एक हिस्सा। इस तरह की परिवर्तनशीलता की व्याख्या और विभिन्न परीक्षणों के बीच परिणामों की तुलना में जटिलता है।
यहां, एक बुनियादी, सस्ती, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बीएएल प्रक्रिया को वर्णित किया गया है जो माउस के वायुमार्ग लुमेन में पेश सेलुलर और घुलनशील अंश के संग्रह की अनुमति देता है। संक्षेप में, एक कैथेटर को उजागर ट्रेकिआ में रखा जाता हैएफए टर्मिनली anesthetized माउस एक सिरिंज कैथेटर से जुड़ा हुआ है, और फेफड़ों में एथिलीनएमीनियमेटेट्रैटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) युक्त एक बफ़ेड खारा समाधान पेश किया जाता है। फेफड़े के लुमेन को नमकीन दोहराया जाता है जो सवार घोल का उपयोग करके हल करता है। इस चरण के दौरान लागू किए गए नकारात्मक दबाव को हवाईअड्डा पतन को रोकने के लिए न्यूनतम है। संग्रह के बाद, प्राप्त बीएएल को संक्रमित किया जाना चाहिए और प्रवाह कोशिका द्वारा कोशिकाओं की पहचान करना चाहिए।
बाल संक्रमण या नशीले पदार्थों के जवाब में कोशिकीय और जैव रासायनिक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है। प्रारंभ में, बाल विषैली गैस विषाक्तता 3 से पीड़ित मानव रोगियों में अत्यधिक बलगम उत्पादन का प्रबंधन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। आजकल, तकनीक फेफड़ों रोगजनन, निदान, और रोगों 3, 24 के चिकित्सीय प्रबंधन की जांच के लिए मानव में प्रयोग किया जाता है। प्रयोगशाला पशुओं में, बाल आमतौर पर उत्तेजित प्रतिक्रियाएं, प्रतिरक्षा तंत्र, और संक्रामक रोग प्रक्रियाओं है कि फेफड़े के वायुमार्ग 1, 2 में होते नजर रखने के लिए प्रयोग किया जाता है।
सांस की बीमारी मॉडल में भड़काऊ सेलुलर पैटर्न का अध्ययन करने के लिए, बाल निरपेक्ष और अंतर सेल गिनती के बाद किया जाना चाहिए। पूर्ण सेल नंबर के अलावा, रिश्तेदार सेल नंबर ब्याज की भी है। उदाहरण के लिए, मरम्मत और कैंसर मॉडल वी दिखानेकोई भी बीएएल सेल गिनती में छोटा नहीं है इस मॉडल में, सेलुलर रचना का आकलन उपयोगी है। प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के साथ संयुक्त सेल धुंधला का उपयोग करके, एओसिनोफिल, न्युट्रोफिल, मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों जैसे विभिन्न कोशिका प्रकारों को आकृति विज्ञान 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 के आधार पर पहचाना जा सकता है। फ्लो साइटमैट्री का उपयोग विशिष्ट आकलन के लिए किया जा सकता है, जैसे विभिन्न टी-सेल फ़िनोटीप्स 7 , 31 को पहचानने के लिए। विभिन्न घुसपैठ सेल आबादी की पहचान के अलावा, फेफड़ों की गैर-सेलुलर संरचना बीएएल का उपयोग करके जांच की जा सकती है। एलीसा, इम्यूनोबलॉट, साइटोकाइन बीड सरणी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया जैसे कि साइटोकाइन, विकास को निर्धारित करने के लिए बाल द्रव पर किया जाता हैकारकों, और अन्य भड़काऊ घटकों। फेफड़ों को नुकसान का निर्धारण करने के लिए, बाल तरल पदार्थ में कुल प्रोटीन और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज का स्तर भी 33 32 मापा जा सकता है।
नई नैदानिक उपकरण के विकास के साथ, बाल घटकों के जीनोमिक और प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन निकट भविष्य में संभव नहीं होगा। कम्प्यूटेशनल क्षमताओं और उच्च throughput जीन अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकियों के विस्तार के संयोजन विभिन्न रोग राज्यों के लिए विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को परिभाषित करने के लिए यह संभव कर देगा। बाल तरल पदार्थ पर इन तकनीकों प्रदर्शन जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न महत्वपूर्ण फेफड़ों के रोगों के विभिन्न चरणों में शामिल अणुओं की पहचान करने दे सकता है।
बाल तरल पदार्थ से प्राप्त डेटा के मुख्य सीमा विभिन्न अनुसंधान परीक्षणों 3, 9 के बीच तुलनात्मकता की कमी है। वहाँ के एक उच्च डिग्री हैLavage तकनीक में परिवर्तनशीलता और बाल द्रव के बाद के प्रसंस्करण। प्रत्येक बीएएल परीक्षण की तुलना करने में सक्षम होने के लिए, उस प्रकार के तरल तरल पदार्थ को मानकीकृत करना जरूरी होता है जो इंसंदित होता है, आसवन की साइट और सेलुलर और गैर-सेलुलर रचना के लिए अंश का विश्लेषण किया जाता है। विभिन्न परीक्षणों के बीच लवण भिन्नताओं की संख्या में महत्वपूर्ण अंतर हैं, एक से 14 गुना 34 , 35 , 36 के बीच अलग-अलग। इस अंतर का फेफड़ों के अनुमानित कुल सेल नंबरों पर असर पड़ सकता है। यह जानने के लिए महत्वपूर्ण है कि कौन से बीएल द्रव अंश में अधिकांश कोशिकाएं हैं गाने एट अल से पता चला है कि कोशिकाओं की कुल संख्या का लगभग 70% अंश एक से तीन 22 में पुनर्प्राप्त किए गए थे। हालांकि, अन्य रिपोर्टों में सुझाव दिया गया कि दूसरा lavage पहले एक 37 , 38 से अधिक कोशिकाओं में अधिक है </sup>। हम इन अध्ययनों से निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि केवल एक भाग के साथ लवण पूरे फेफड़ों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, जिससे परिणाम का गलत अर्थ हो सकता है।
बाल द्रव के गैर-कोशिकी संरचना में फुफ्फुस 33 , 3 9 , 40 की स्वास्थ्य स्थिति के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी है। बाल द्रव के कमजोर पड़ने में बदलाव, घुलनशील अंश की मात्रा का ठहराव में अंतर करने के लिए और इसके परिणामस्वरूप, परीक्षणों के बीच के परिणामों में अंतर करने के लिए योगदान देता है। गाने एट अल प्रत्येक lavage अंश के प्रोटीन और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज के स्तर की तुलना में और निष्कर्ष निकाला है कि पहली lavage अंश में दूसरा अंश से दो से तीन गुना अधिक होता है
विश्लेषण के लिए एक प्रतिनिधि बीएएल नमूना प्राप्त करने के लिए, कुछ तकनीकी विचार महत्वपूर्ण हैं। उनमें से एक उचित anesthetization प्रदर्शन करने के लिए है पैर रेफरी की जांच करना बहुत महत्वपूर्ण हैमाउस के लेक्स टर्मिनल बेहोश करने की क्रिया के लिए सुनिश्चित करें। यह न केवल नैतिक कारणों से महत्वपूर्ण है, बल्कि इसलिए भी कि यह मुश्किल है जगह है और अगर माउस को ठीक से संज्ञाहरण नहीं है सही स्थिति में कैथेटर बनाए रखने के लिए।
एक दूसरा महत्वपूर्ण तकनीकी विचार श्वासनली में कैथेटर की स्थिति है। जब कैथेटर बहुत गहरा डाला जाता है, यह फेफड़ों संरचना को नुकसान पहुंचा सकता। कैथेटर के दूरस्थ सिरे बाल प्रक्रिया के दौरान फेफड़ों तक पहुँच नहीं करना चाहिए। कैथेटर भी स्थिर हो और एक कपास धागे के साथ बंद बंधे किया जाना चाहिए। कैथेटर स्थिर नहीं है, तो इंजेक्शन नमकीन घोल फेफड़ों में बजाय नीचे नाक गुहा में ऊपर की तरफ प्रवाह हो सकता है। इंजेक्शन और नमकीन घोल की आकांक्षा के दौरान, यह कैथेटर नियमित रखना महत्वपूर्ण है।
डेटा बाल तरल पदार्थ से प्राप्त पूरे murine फेफड़ों का प्रतिनिधित्व करना चाहिए। इसलिए, यह खारा बफर की पर्याप्त मात्रा पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है (यानी3 एमएल, 1 एमएल प्रत्येक) के 3 aliquots में विभाजित है। वहाँ सेल उपज और बाल तरल पदार्थ उपज के बीच कोई रैखिक संबंध है। यह जबकि माउस की छाती की मालिश धीरे समाधान इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है। बाल काटना बलों भी मजबूत कर रहे हैं, व्यवहार्यता, समारोह, और वायुमार्ग और बाल तरल पदार्थ के भीतर कोशिकाओं की संरचना समझौता किया जा सकता। aspirated द्रव सिरिंज में दिखाई नहीं देता है, ध्यान से कैथेटर गहरी या श्वासनली में ऊपर की ओर बढ़ते।
विशेष नोटिस बाल प्रसंस्करण और विश्लेषण के विशिष्ट पहलुओं को दी जानी चाहिए। यह जानकारी बाल के नमूनों से बनाए रखा बढ़ा सकते हैं। बाल के बाद, कोशिकाओं एक कम-पोषण वाले खारा माध्यम में कर रहे हैं। इसलिए यह 1 घंटे बाल नमूना के बाद भीतर नमूने पर कार्रवाई करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। अगर लंबे समय तक भंडारण के लिए आवश्यक है, एक पोषक तत्व पूरक माध्यम के उपयोग की आवश्यकता है।
सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, ट्यूब कि सतह के लिए सेल पालन को बढ़ावा देने से बचें। ce से बचेंगति कि सेलुलर अखंडता के साथ समझौता करने के लिए या पुनः प्राप्त बाल कोशिकाओं की वर्दी मेजबान को रोकने के लिए की संभावना है पर सेल निलंबन की ntrifugation। बाल तरल पदार्थ युक्त कोशिकाओं 400 XG और 7 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifuged किया जाना चाहिए। ऐसा नहीं है कि सेल निलंबन प्रसंस्करण के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाना चाहिए ध्यान में रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
The authors have nothing to disclose.
एलवीएच गेन्ट यूनिवर्सिटी के बायोमेडिकल आणविक जीवविज्ञान विभाग में एक शोध सहायक है। ईआरजे यूनिवाकफ्लू द्वारा अनुदान संख्या 6076 9 0 द्वारा समर्थित है। केआर को ईसी-एफपी 7 परियोजना FLUNIVAC द्वारा समर्थित है।
balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
flow cytometer | BD Biosciences | ||
catheter | BD Biosciences | 393202 |