Het analyseren van dendrietmorfologie in Kolommen en Lagen
Summary
Hier laten we zien hoe dendritische routering van Drosophila merg neuronen in de kolommen en lagen te analyseren. De werkstroom een dual-beeldvorming techniek om de beeldkwaliteit en computerhulpmiddelen voor opsporing, registratie dendritische assen aan de hand kolommatrix en voor de analyse van dendritische structuren in 3D te verbeteren.
Abstract
In veel regio's van het centrale zenuwstelsel, zoals de vlieg optische lobben en de vertebraat cortex worden synaptische circuits georganiseerd in lagen en kolommen hersenen bedrading tijdens de ontwikkeling en informatiesystemen ontwikkeld in dieren te vergemakkelijken. Postsynaptische neuronen uitgebreide dendrieten in type-specifieke patronen in bepaalde lagen om synaps met de juiste presynaptische terminals. De fly merg neuropil bestaat uit 10 lagen en ongeveer 750 kolommen; elke kolom wordt geïnnerveerd door dendrieten van meer dan 38 soorten merg neuronen, die overeenkomen met de axonale terminals van ongeveer 7 soorten afferentia in een type-specifieke manier. Dit rapport beschrijft de procedures voor het imago en de dendrieten van merg neuronen te analyseren. De workflow bestaat uit drie onderdelen: (i) de dual-view beeldvorming sectie combineert twee confocale image stacks verzameld op orthogonale oriëntaties een hoge resolutie 3D-beeld van dendrieten in; (Ii) de dendrite opsporing en registratie sectie sporen dendritischepriëlen in 3D en registreert dendritische sporen met de referentie-kolom-array; (Iii) de dendritische analyse deel wordt dendritische patronen ten opzichte van kolommen en lagen, waaronder laagspecifieke beëindiging en vlakke projectierichting van dendritische spillen afleidt ramingen van dendritische vertakking en beëindiging frequenties. De protocollen maken gebruik van aangepaste plugins gebouwd op het open-source MIPAV (Medical Imaging verwerking, analyse en visualisatie) platform en aangepaste gereedschapskisten in de matrix laboratorium taal. Samen vormen deze protocollen een volledige workflow de dendritische routering van Drosophila medulla neuronen in lagen en kolommen analyseren, om celtypen te identificeren, en om defecten in mutanten bepalen.
Introduction
Tijdens de ontwikkeling neuronen uitgebreide dendrieten in complex maar stereotype vertakte patronen synapsen met hun presynaptische partners. Dendritische vertakking patronen correleert met neuronale identiteit en functies. De locaties van dendritische priëlen bepalen het type presynaptische inputs die zij ontvangen, terwijl de dendritische vertakking complexiteit en veld maten regelt de input nummer. Zo dendritische morfologische eigenschappen zijn cruciaal determinanten van synaptische connectiviteit en neuronale berekening. In veel regio's van complexe hersenen, zoals de vlieg optische kwabben en gewervelde netvlies worden synaptische circuits georganiseerd in lagen en kolommen informatieverwerking 1, 2 vergemakkelijken. In dergelijke kolom en laag organisatie presynaptische neuronen van een afzonderlijke modaliteit project axonen te eindigen bij een bepaalde laag (zogenaamde layer-specifieke targeting) en een ordelijke tweedimensionale matrix vormen (zogenaamde called topografische kaart), terwijl de postsynaptische neuronen uit te breiden dendrieten van de juiste afmetingen in bepaalde lagen om presynaptische ingangen van de juiste soorten en aantallen ontvangen. Terwijl axonale targeting lagen en kolommen is goed bestudeerd 3, 4, is veel minder bekend over hoe dendrieten worden naar specifieke lagen en vergroten de juiste maat receptieve velden synaptische verbindingen met de juiste partners presynaptische 5 vormen. De moeilijkheid van de beeldvorming en kwantificeren van dendritische richten naar lagen en kolommen heeft de studie van de dendritische ontwikkeling in zuilvormige en gelamineerde hersenstructuren belemmerd.
Drosophila merg neuronen zijn een ideaal model voor het bestuderen van dendritische routing en circuit assemblage in de kolommen en lagen. De fly merg neuropil is georganiseerd als een 3D rooster van 10 lagen en ongeveer 750 kolommen. Elke kolom wordt geprikkeld door een set afferentia, waaronder photoreceptors R7 / R8 en lamina neuronen L1 – L5, waarvan de axonen terminals vormen topografische kaarten in een laag-specifieke wijze 6. Ongeveer 38 soorten merg neuronen zijn aanwezig in elke kolom merg en uitgebreide dendrieten in specifieke lagen en met de juiste veld maten om input te ontvangen van deze afferenten 7. De synaptische circuits in de medulla werden gereconstrueerd op het elektronenmicroscopische niveau; Zo zijn de synaptische samenwerking gevestigde 7, 8. Bovendien genetische hulpmiddelen voor etikettering verschillende soorten neuronen medulla zijn 9, 10, 11. Bij de behandeling van drie soorten transmedulla (Tm) neuronen (Tm2, Tm9 en TM20), hebben we eerder geïdentificeerd twee cel-type-specifieke dendritische attributen: (i) Tm neuronen projecteren dendrieten in zowel de voorste of achterste richting (vlakke projectie richting), afhankelijk van het type cel en (ii) dendrieten van neuronen medulla beëindigen specifieke medulla lagen in een celtype-specifieke wijze (laagspecifieke beëindiging) 12. Planar projectierichting en laagspecifieke beëindiging voldoende om deze drie soorten Tm neuronen differentiëren, terwijl mutaties die Tm reacties op laag en kolom signalen verstoren invloed verschillende aspecten van deze kenmerken.
Hier presenteren we een complete workflow voor de behandeling van dendritische patroonvorming van Drosophila medulla neuronen in lagen en kolommen (figuur 1). Ten eerste tonen we een dual-beeldvorming methode, die aangepaste software gebruikt twee confocale beeld combineren stapels van hoge kwaliteit isotrope beelden genereren. Deze methode vereist slechts conventionele confocale microscopie om beelden van hoge kwaliteit die het mogelijk maken voor een betrouwbare tracering van dendritische filialen te genereren, zonder toevlucht te nemen tot super-resolutie microscopie, zoals eens STED (gestimuleerde emissie uitputting) of structurele verlichting. Ten tweede presenteren we een methode voor het opsporen dendritische assen en voor het registreren van de resulterende neurieten sporen een referentie kolommatrix. Ten derde, tonen we de computationele werkwijzen voor extraheren van informatie over het vlakke projectierichting en laagspecifieke beëindiging van dendrieten, en voor het afleiden schattingen dendritische vertakking en beëindiging frequenties. Samen zijn deze methoden is het mogelijk voor de karakterisering van dendritische patronen in 3D, de indeling van celtypen op basis van dendritische morfologie, en de identificatie van mogelijke gebreken in mutanten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier laten we zien hoe beeld en analyseren van dendritische priëlen van Drosophila merg neuronen. Het eerste deel, dual-view beeldvorming, beschrijft de deconvolutie en de combinatie van twee beeld stacks in een afbeelding stapel hoge resolutie. Het tweede deel, dendrite tracing en registratie, beschrijft de opsporing en registratie van de dendrieten van merg neuronen aan de kolomverwijzing array. Het derde deel, dendritische analyse, beschrijft het gebruik van aangepaste scripts dendritische patronen te analy…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (subsidie HD008913 aan C.-HL) en het Centrum voor Informatie Technologie (PGM, NP, ESM en MM).
Materials
| Software | |||
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | version 16.05 | for image deconvolution (https://svi.nl). commercial software |
| MIPAV | version 7.3.0 | for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/.). freeware | |
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaRetinalRegistration.class | freeware | ||
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandardColumnRegistration.class | freeware | ||
| Imaris | Bitplane | for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com). commercial software | |
| Vaa3D | for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/). freeware | ||
| Matlab | Mathworks | R2014b | for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com). commercial software |
| Matlab toolbox: TREES1.14 | v1.14 | for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html). freeware | |
| Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox | v1.0 | for calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Sample files | |||
| SWC file definition | http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html | ||
| The codes and sample files for image combination and registration | https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration | ||
| Reference point example | https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=1471880596000&api=v2 | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Computer system | |||
| MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later | 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal) | ||
| Optional: Quadro4000 (or above) graphic card | Nvidia | for stereographic visualization of dendrites. | |
| Optional: NVIDIA 3D vision2 | Nvidia | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html | |
| Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Reagents for imaging | |||
| 24B10 antibody | The Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Tag Antibody | Thermofisher Scientific | G10362 | |
| Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermofisher Scientific | A11034 | |
| Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermofisher Scientific | A21124 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mounting Clay | Fisher | S04179 | |
| 70% glycerol in 1X PBS | |||
| Cover glasses, high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9000-000 |
References
- Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
- Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
- Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743 (2010).
- Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
- Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
- Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. . The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , 1363-1491 (1993).
- Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
- Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
- Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
- Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
- Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
- Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
- Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
- Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
- Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
- Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).
