L'utilisation des dispositifs microfluidiques pour mesurer et cellulaire Lifespan dans Phenotypes simples cellules de levure de bourgeonnement

Summary

Cet article présente un protocole optimisé pour la production de puces microfluidiques et la mise en place d'expériences microfluidique pour mesurer la durée de vie et phénotypes cellulaires de cellules de levure unique.

Abstract

La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae est un organisme modèle important dans la recherche sur le vieillissement. Des études génétiques ont révélé de nombreux gènes ayant des effets conservés sur la durée de vie de toutes les espèces. Cependant, les causes moléculaires du vieillissement et de la mort restent insaisissables. Pour obtenir une compréhension systématique des mécanismes moléculaires sous-jacents au vieillissement de la levure, nous avons besoin de méthodes à haut débit pour mesurer la durée de vie et quantifier divers phénotypes cellulaires et moléculaires dans des cellules uniques. Auparavant, nous avons développé des dispositifs microfluidiques pour suivre les cellules mères de levure bourgeonnantes tout au long de leur vie tout en éliminant les cellules filles nouveau-nées. Cet article présente une méthode de préparation de puces microfluidiques et de mise en place d’expériences microfluidiques. Plusieurs canaux peuvent être utilisés pour suivre simultanément des cellules dans différentes conditions ou à partir de différentes souches de levure. Une configuration typique peut suivre des centaines de cellules par canal et permettre une imagerie au microscope haute résolution tout au long de la durée de vie des cellules. Notre méthode permet également une caractérisation détaillée de la durée de vie, des marqueurs moléculaires, de la morphologie cellulaire et de la dynamique du cycle cellulaire des cellules individuelles. De plus, notre dispositif microfluidique est capable de piéger une quantité importante de cellules mères fraîches qui peuvent être identifiées par l’analyse d’images en aval, ce qui permet de mesurer la durée de vie avec une plus grande précision.

Introduction

levure bourgeonnante est un organisme modèle puissant recherche sur le vieillissement. Cependant, un essai de durée de vie classique dans la levure repose sur microdissection, qui est non seulement de main - d'œuvre , mais aussi faible débit ^{1, 2.} De plus, l'approche traditionnelle microdissection ne fournit pas une vue détaillée de diverses fonctions cellulaires et moléculaires dans les cellules mère seule à mesure qu'ils vieillissent. Le développement de dispositifs microfluidiques a permis une procédure automatisée pour mesurer la durée de vie de la levure ainsi que de suivre les marqueurs molé....

Protocol

1. Silicon Wafer Fabrication de moules

REMARQUE: Le photomasque est conçu avec le logiciel AutoCAD et fabriqué par une société commerciale. Cette conception contient trois couches de différents motifs ( Fichier supplémentaire 1 ). Les hauteurs des première, deuxième, et troisième couches sont d'environ 4 um, 10 um et 50 um, respectivement. Le moule de la tranche de silicium a été créé à partir du photomasque en utilisant la lithographie douce ^{9, 10.}

1. Faire cuire au four une plaquette de sil....

Results

Après les expériences, les cellules des durées de vie et de nombreux phénotypes cellulaires et moléculaires peuvent être extraites des images en accéléré enregistrées. Comme il existe un certain nombre de caractéristiques qui peuvent être extraits à partir de chaque cellule, la première étape de l'analyse consiste à annoter les cellules et les événements, y compris les positions et les limites des cellules et la synchronisation des différents événements qui sont suivis, par exemple comme.......

Discussion

Le dispositif PDMS doit être fraîchement préparé. Sinon, les bulles d'air provoquées par l'insertion des tubes dans le dispositif sera difficile à enlever. Étape 3.4 est important d'améliorer l'efficacité de chargement des cellules en concentrant les cellules. Pour augmenter le débit de l'expérience, quatre à six modules sur la même puce de PDMS reliés à des pompes fonctionnant indépendamment sont généralement utilisés pour effectuer 4 à 6 expériences différentes (souches différentes ou des compositi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' < Plaquette de silicium 111>	Addison Engineering
SU-8 séries 2000 et 3000	MicroChem
Sylgard® ; 184 Kit d’élastomère de silicone	ellsworth	2065622	Comprend une base en élastomère de silicone Sylgard® ; et un agent de durcissement Boîtes
de Pétri	VWR	391-1502
Harris Uni-core&trade ; poinçon (D.I. 0,75 mm)	Sigma-Aldrich
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® ;	verre de protection Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® ; Lames de rasoir	VWR	55411-050
Éthanol pur, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster&trade ;	VWR	16650-027
Seringue BD 5 mL (Luer-Lock&trade ; Astuce)	Becton, Dickinson and Company	309646
Tube mural standard en PTFE (100 pi, AWG Taille : 22, ID nominal : 0.028)	Component Supply Company	SWTT-22
Assortiment d’aiguilles	Component Supply Company	NEKIT-1
Dessiccateur	HACH	2238300
Four de laboratoire	Fisher Scientific	13246516GAQ
Microscope Nikon TE2000 avec objectif 40X et 60X	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 avec objectif 40X et 60X	Zeiss
Longerpump		TS-1B