استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة
Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكول الأمثل لإنتاج رقائق ميكروفلويديك وإعداد التجارب الموائع الدقيقة لقياس عمر والظواهر الخلوية من خلايا الخميرة واحدة.
Abstract
Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.
Introduction
في مهدها الخميرة يعد مصدرا قويا لنموذج حي في الشيخوخة البحوث. ومع ذلك، فحص عمر التقليدية في الخميرة يعتمد على تسليخ مجهري، وهو عمل ليس فقط المكثف ولكن أيضا انخفاض الإنتاجية 1 و 2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج التقليدي تسليخ مجهري لا يقدم على عرض تفصيلي لمختلف الخصائص الخلوية والجزيئية في الخلايا الأم واحدة مع تقدمهم في السن. وقد مكن تطوير أجهزة ميكروفلويديك إجراء الآلي لقياس الخميرة عمر وكذلك لمتابعة الواسمات الجزيئية ومختلف الظواهر الخلوية في مختلف مراحل العمر من الخلايا الأم 3، 4، 5، 6، 7، 8. بعد تحميل خلايا الخميرة في جهاز ميكروفلويديك، فإنها يمكن تتبع تحت المجهر باستخدام التلقائي الوقت فاتالبريد التصوير. مع مساعدة من التصوير تجهيز الأدوات، ومختلف الظواهر الخلوية والجزيئية يمكن استخراج 3، 6، 8، بما في ذلك عمر، حجم، مراسل فلوري، مورفولوجيا الخلايا، وديناميات دورة الخلية، وما إلى ذلك، وكثير منها يصعب أو يستحيل الحصول باستخدام طريقة تسليخ مجهري التقليدي. اكتسبت أجهزة ميكروفلويديك مكانة بارزة في البحوث الخميرة الشيخوخة منذ التطوير الناجح من قبل بضع سنوات 3 و 4 و 6 و 7. وقد نشرت عدة مجموعات في وقت لاحق على أشكال مختلفة من التصاميم السابقة 5، والعديد من معامل الخميرة قد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك لدراستهم.
في ثقافة خلية تشهد نموا مطردا، وعدد الخلايا الأم في سن المتوفرة للمراقبة هو miniscuجنيه. ولذلك، فإن مبدأ التصميم العام للجهاز ميكروفلويديك لقياس عمر هو الإبقاء الخلايا الأم ولإزالة الخلايا الوليدة. واحدة من هذه التصاميم يستفيد من حقيقة أن الخميرة يخضع انقسام الخلايا غير المتماثلة. الهياكل في الخلايا الأم إرادة جهاز فخ اكبر وتسمح للخلايا ابنته الصغيرة التي يجب غسلها بعيدا. يستخدم رقاقة ميكروفلويديك الموصوفة في هذه المقالة polydimethylsiloxane لينة (PDMS) لوحة (الأعمدة متدل العمودي) إلى خلايا فخ الأم (الشكل 1). وقد تم الإبلاغ عن الأجهزة من تصميم مماثل سابقا 3 و 4 و 6 و 7. يستخدم هذا البروتوكول إجراء أبسط لصنع أجهزة ميكروفلويديك واضحة طريقة خلية التحميل التي يتم أمثل للتجارب الوقت الفاصل بين التصوير. واحدة من المعالم الرئيسية في الجهاز ميكروفلويديك هو العرض من منصات PDMS تستخدم لخلايا فخ الأم. لدينا ديستخدم evice منصات أوسع يمكن أن تبقي أكثر من الخلايا الأم تحت كل لوحة، بما في ذلك جزء كبير من الخلايا الأم العذبة التي يمكن تتبعها طيلة حياتها. بالإضافة إلى قياسات عمر، وهذا البروتوكول هو مفيد لتجارب التصوير وحيد الخلية مرور الزمن عندما تحتاج لتعقبها لأجيال عديدة أو عند ملاحظة طوال العمر كله ضروري الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحتاج إلى أن تقدم طازجة الجهاز PDMS. وإلا فإن فقاعات الهواء الناجم عن إدخال الأنابيب في الجهاز يكون من الصعب إزالتها. الخطوة 3.4 هامة لتحسين كفاءة الخلايا تحميل من خلال التركيز الخلايا. لزيادة سرعة نقل التجربة، من 4 إلى 6 وحدات على الشريحة نفسها PDMS متصلة تستخدم مضخات تعمل …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.
Materials
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| PURE ETHANOL, KOPTEC | VWR | 64-17-5 | |
| WHOOSH-DUSTER™ | VWR | 16650-027 | |
| 5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip) | Becton, Dickinson and Company. | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028) | COMPONENT SUPPLY COMPANY | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | COMPONENT SUPPLY COMPANY | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | FISHER SCIENTIFIC | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
- Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
- Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, ., Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143 (2013).
- Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
- Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
- Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).
