Brug mikrofluidenheder til måling Levetid og cellefænotyper i Single Spirende gærceller
Summary
Denne artikel præsenterer en protokol optimeret til produktion af mikrofluide chips og opsætningen af mikrofluide eksperimenter til måling af levetid og cellulære fænotyper af enkelte gærceller.
Abstract
Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.
Introduction
Spirende gær er en kraftfuld model organisme i aldring forskning. Men en konventionel levetid assay i gær bygger på mikrodissektion, som ikke kun er arbejdskrævende, men også lav gennemløb 1, 2. Hertil kommer, at den traditionelle mikrodissektion fremgangsmåde ikke giver et detaljeret billede af forskellige cellulære og molekylære egenskaber i de enkelte moderceller som de bliver ældre. Udviklingen af mikrofluidenheder har muliggjort en automatiseret procedure til måling af gær levetid samt til at følge molekylære markører og forskellige cellulære fænotyper igennem hele livet af moderceller 3, 4, 5, 6, 7, 8. Efter gærceller fyldes i en mikrofluidanordning, kan de spores under et mikroskop under anvendelse af automatiske tidspunkter omgangee billeddannelse. Ved hjælp af billeddannelse værktøjer kan forskellige cellulære og molekylære fænotyper ekstraheres 3, 6, 8, herunder levetid, størrelse, fluorescerende reporter, cellemorfologi, cellecyklus dynamik, etc., hvoraf mange er vanskelige eller umulige at opnå ved hjælp af den traditionelle mikrodissektion metode. Mikrofluidenheder har fået fremtrædende plads i gær aldring forskning siden deres succesfulde udvikling for et par år siden 3, 4, 6, 7. Adskillige grupper har efterfølgende offentliggjort på variationer i de tidligere designs 5, og mange gær laboratorier har ansat mikrofluidenheder for deres undersøgelse.
I en cellekultur undergår eksponentiel vækst, antallet af alderen moderceller der er tilgængelige for observation er miniscule. Derfor er den generelle udformning princip mikrofluidapparatet for levetidsspecifikationerne målinger er at fastholde modercellerne og fjerne datterceller. En sådanne design gør brug af det faktum, at gær gennemgår asymmetrisk celledeling. Strukturerne i enheden vil fælde større mor-celler og tillader mindre datterceller at blive vasket væk. Den mikro chip er beskrevet i denne artikel bruger en blød polydimethylsiloxan (PDMS) pude (vertikale Pensile søjler) til fælde mor celler (figur 1). Indretninger af lignende udformning har tidligere 3, 4, 6, 7 er rapporteret. Denne protokol anvender en enklere procedure til at fremstille mikrofluidenheder og en enkel celle-loading metode, der er optimeret til time-lapse billeddannelse eksperimenter. En af de vigtigste parametre i mikrofluidanordning er bredden af PDMS puder bruges til at fælde modercellerne. Vores device bruger bredere puder, der kan holde flere mor celler under hver pude, herunder en signifikant fraktion af friske moderceller der kan spores hele deres levetid. Foruden levetidsspecifikationerne målinger denne protokol er nyttig til enkeltcelle time-lapse imaging eksperimenter, når cellerne skal spores i mange generationer, eller når en observation i hele levetid er nødvendig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den PDMS enhed skal være frisk gjort. Ellers vil luftboblerne forårsaget ved at indsætte rør i indretningen være vanskeligt at fjerne. Trin 3.4 er vigtigt at forbedre celle lastning effektivitet ved at koncentrere cellerne. For at forøge throughput af eksperimentet, 4 til 6 moduler på samme PDMS chip forbundet til selvstændigt driver pumperne typisk til at udføre 4 til 6 forskellige eksperimenter (forskellige stammer eller medier sammensætninger) samtidigt.
Sammenlignet med den kon…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.
Materials
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| PURE ETHANOL, KOPTEC | VWR | 64-17-5 | |
| WHOOSH-DUSTER™ | VWR | 16650-027 | |
| 5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip) | Becton, Dickinson and Company. | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028) | COMPONENT SUPPLY COMPANY | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | COMPONENT SUPPLY COMPANY | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | FISHER SCIENTIFIC | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
- Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
- Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, ., Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143 (2013).
- Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
- Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
- Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).
