Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen
Summary
Dit artikel een protocol geoptimaliseerd voor het vervaardigen van microfluïdische chips en de opstelling van microfluïdische experimenten om de levensduur en cellulaire fenotypen van afzonderlijke gistcellen te meten.
Abstract
Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.
Introduction
Gist is een krachtige modelorganisme bij veroudering onderzoek. Echter, een gebruikelijke levensduur assay gist voert microdissectie, die niet alleen arbeidsintensief maar ook lage doorzet 1, 2. Bovendien is de traditionele microdissectie aanpak voorziet niet in een gedetailleerde weergave van verschillende cellulaire en moleculaire kenmerken van de alleenstaande moeder cellen als ze ouder worden. De ontwikkeling van microfluïdische apparaten is een geautomatiseerd systeem voor gist levensduur te meten en om moleculaire merkers en verscheidene cellulaire fenotypes volgen gedurende de levensduur van de moedercellen 3, 4, 5, 6, 7, 8 ingeschakeld. Na gistcellen in een microfluïdische inrichting zijn geladen, kunnen zij worden gevolgd onder een microscoop met automatische tijdsafhankelijkee beeldvorming. Met behulp van beeldvorming bewerkgereedschappen kunnen verschillende cellulaire en moleculaire fenotypes worden geëxtraheerd 3, 6, 8, zoals levensduur, formaat, fluorescente reporter, celmorfologie, cel cyclus dynamica, etc., waarvan vele zijn moeilijk of onmogelijk te verkrijgen met behulp de traditionele microdissectie methode. Microfluïdische apparaten hebben opgedaan bekendheid in gist veroudering onderzoek sinds hun succesvolle ontwikkeling van een paar jaar geleden 3, 4, 6, 7. Verschillende groepen zijn vervolgens gepubliceerd op variaties van de eerdere ontwerpen 5, en veel gist labs hebben microfluïdische apparaten gebruikt voor hun studie.
In een celcultuur exponentiële groei ondergaan, het aantal bejaarde moeder cellen die voor observatie beschikbaar zijn, is miniscule. Daarom is het algemene ontwerpprincipe van de microfluïdische inrichting voor levensduur metingen te moedercellen behouden en dochtercellen te verwijderen. Een dergelijk ontwerp maakt gebruik van het feit dat gist ondergaat asymmetrische celdeling. De structuren in de inrichting wil houden groter moedercellen en laten kleinere dochtercellen weg te wassen. De microfluïdische chip in dit artikel wordt een zachte polydimethylsiloxaan (PDMS) pad (verticaal hangend kolommen) te controleren moedercellen (figuur 1). Inrichtingen van vergelijkbaar type zijn eerder 3, 4, 6, 7 gemeld. Dit protocol maakt gebruik van een eenvoudiger procedure microfluïdische inrichtingen en een eenvoudige cel-laadmethode die is geoptimaliseerd voor de time-lapse imaging experimenten fabriceren. Een van de belangrijkste parameters in de microfluïdische inrichting is de breedte van de PDMS kussens gebruikt te controleren moedercellen. onze device gebruikt breder pads die meer moeder cellen onder elke pad kan houden, met inbegrip van een aanzienlijk deel van de verse moeder cellen die gedurende hun levensduur kunnen gevolgd worden. Naast levensduur metingen Dit protocol is bruikbaar voor enkele cel time-lapse imaging experimenten wanneer de cellen moeten worden bijgehouden voor vele generaties of bij een waarneming gedurende de gehele levensduur noodzakelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
De PDMS apparaat moet vers worden gemaakt. Anders zullen de luchtbellen veroorzaakt door het inbrengen van buizen in de inrichting moeilijk te verwijderen. Stap 3.4 is belangrijk voor de celbelasting efficiëntie door het concentreren van de cellen. Om het debiet van het experiment te verhogen, 4-6 modules op dezelfde PDMS chip verbonden met autonoom werkende pompen worden gewoonlijk gebruikt voor het uitvoeren 4-6 verschillende experimenten (verschillende stammen of mediacomposities) tegelijk.
<p class="jove_conten…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.
Materials
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| PURE ETHANOL, KOPTEC | VWR | 64-17-5 | |
| WHOOSH-DUSTER™ | VWR | 16650-027 | |
| 5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip) | Becton, Dickinson and Company. | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028) | COMPONENT SUPPLY COMPANY | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | COMPONENT SUPPLY COMPANY | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | FISHER SCIENTIFIC | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
- Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
- Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, ., Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143 (2013).
- Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
- Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
- Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).
