एनजाइम आधारित Biosensors का उपयोग अल्जाइमर माउस मॉडल में टॉनिक और phasic ग्लूटामेट की माप के लिए
Summary
यहाँ, हम टॉनिक और एंजाइम-लिंक्ड microelectrode सरणियों (विदेश मंत्रालय) का उपयोग विवो में phasic बाह्य ग्लूटामेट परिवर्तन को मापने का एक स्थानिक और अस्थायी सटीक तरीका के लिए सेटअप, सॉफ्टवेयर नेविगेशन, और डेटा विश्लेषण का वर्णन।
Abstract
स्नायुसंचारी विघटन अक्सर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के रोगों का एक प्रमुख घटक, पैथोलॉजी अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, अवसाद और चिंता अंतर्निहित में एक भूमिका निभा रहा है। परंपरागत रूप से, microdialysis सबसे आम (सराहना) तकनीक न्यूरोट्रांसमीटर परिवर्तन है कि इन विकारों में होते हैं जांच करने के लिए किया गया है। लेकिन क्योंकि microdialysis ऊतक के बड़े क्षेत्रों भर में धीमी गति से 1-20 मिनट परिवर्तन को मापने की क्षमता है, यह invasiveness का नुकसान, संभवतः मस्तिष्क और एक धीमी गति से नमूना क्षमता के भीतर आंतरिक कनेक्शन को नष्ट करने है। एक अपेक्षाकृत नई तकनीक, microelectrode सरणी (विदेश मंत्रालय), असतत मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर विशिष्ट न्यूरोट्रांसमीटर बदलाव का आकलन के रूप में वे होते हैं, एक स्थानिक और अस्थायी सटीक दृष्टिकोण के लिए बनाने के लिए कई फायदे हैं। इसके अलावा, Meas का उपयोग कर विवो में न्यूरोट्रांसमीटर परिवर्तन की माप के लिए अनुमति देता है न्यूनतम इनवेसिव है। हमारे प्रयोगशाला में, हम हाविशेष रूप से न्यूरोट्रांसमीटर, ग्लूटामेट, अल्जाइमर रोग विकृति से संबंधित में परिवर्तन में रुचि किया गया है। जैसे, विधि यहाँ वर्णित अल्जाइमर रोग के एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में ग्लूटामेट में संभावित हिप्पोकैम्पस अवरोधों का आकलन किया गया है। संक्षेप में, विधि का इस्तेमाल किया एक एंजाइम ब्याज और पृष्ठभूमि शोर और interferents बाहर घटाना करने के लिए स्वयं को संदर्भित साइटों के उपयोग की न्यूरोट्रांसमीटर के लिए बहुत चयनात्मक के साथ एक बहु साइट microelectrode कोटिंग शामिल है। चढ़ाना और अंशांकन के बाद, विदेश मंत्रालय एक micropipette के साथ निर्माण किया जा सकता है और एक stereotaxic डिवाइस का उपयोग कर ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र में उतारा। इधर, विधि वर्णित RTG (TauP301L) 4510 चूहों anesthetizing और एक stereotaxic डिवाइस का उपयोग कर ठीक लक्षित करने के लिए उप-क्षेत्रों हिप्पोकैम्पस के (डीजी, सीए 1, और सीए 3) शामिल है।
Introduction
मापने मस्तिष्क में न्यूरोट्रांसमीटर परिवर्तन केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) है कि अक्सर न्यूरोट्रांसमीटर अनियंत्रण की विशेषता है के रोगों का अध्ययन neuroscientists लिए एक अनिवार्य उपकरण है। हालांकि उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC / ईसी) के साथ संयोजन में microdialysis सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि बाह्य न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर 1, 2, में परिवर्तन को मापने के किया गया है 3, 4, microdialysis जांच के स्थानिक और लौकिक संकल्प नहीं न्यूरोट्रांसमीटर के लिए आदर्श हो सकता है , इस तरह के ग्लूटामेट, कि कसकर बाह्य अंतरिक्ष 5, 6 में विनियमित किया जाता है के रूप में। क्योंकि आनुवंशिकी और इमेजिंग में हाल के अग्रिमों की, वहाँ अतिरिक्त तरीकों कि विवो में ग्लूटामेट मैप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ग्लूटामेट फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग करना (iGluSnFR) एकघ दो फोटॉन इमेजिंग, शोधकर्ताओं न्यूरॉन्स और दोनों इन विट्रो में और vivo 7, 8, 9 में astrocytes से ग्लूटामेट रिहाई कल्पना करने के लिए सक्षम हैं। विशेष रूप से, इस दृश्य का एक बड़ा क्षेत्र से रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है और मस्तिष्क के आंतरिक कनेक्शन को बाधित नहीं करता। इन नए ऑप्टिकल तकनीक ग्लूटामेट गतिकी और संवेदी पैदा की प्रतिक्रियाएं और neuronal गतिविधि की माप के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं, वे असतत मस्तिष्क क्षेत्रों में बाह्य अंतरिक्ष में ग्लूटामेट की राशि यों करने की क्षमता की कमी है।
एक वैकल्पिक पद्धति एंजाइम से जुड़ी microelectrode सरणी (विदेश मंत्रालय) जो चुनिन्दा एक आत्म संदर्भित रिकॉर्डिंग योजना के उपयोग के माध्यम से इस तरह के रूप में ग्लूटामेट बाह्य न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर, माप सकते हैं है। विदेश मंत्रालय तकनीक दर्दनाक मस्तिष्क निम्नलिखित बाह्य ग्लूटामेट में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैचोट 10, 11, 12, उम्र बढ़ने 13, 14, तनाव 15, 16, मिर्गी 17, 18, अल्जाइमर रोग 19, 20, और एक वायरल नकल 21 के इंजेक्शन और microdialysis में निहित स्थानिक और लौकिक सीमाओं के ऊपर एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता है। जबकि microdialysis अन्तर्ग्रथन 22, 23 के पास मापने की क्षमता को प्रतिबंधित करता है, Meas एक उच्च स्थानिक संकल्प बाह्य ग्लूटामेट spillover के चुनिंदा उपायों के पास synapses के लिए 24, 25 के लिए अनुमति देता है। दूसरा, microdialysis की कम अस्थायी संकल्प (1 – 20 मिनट) जांच करने की क्षमता को सीमित करता हैग्लूटामेट रिहाई और निकासी की तेजी से गतिशीलता दूसरी रेंज से 26 मिलीसेकंड में होने वाली। क्योंकि रिहाई या ग्लूटामेट की निकासी में अंतर टॉनिक के उपायों, ग्लूटामेट स्तरों आराम में स्पष्ट नहीं हो सकता है, यह आवश्यक हो सकता है कि ग्लूटामेट रिहाई और निकासी सीधे मापा जा। Meas अपने उच्च लौकिक संकल्प (2 हर्ट्ज) और पता लगाने की कम सीमा (<1 माइक्रोन) की वजह से इस तरह के उपायों के लिए अनुमति देते हैं। तीसरा, Meas इस तरह के चूहे या माउस हिप्पोकैम्पस के रूप में एक विशेष मस्तिष्क क्षेत्र के भीतर न्यूरोट्रांसमीटर में उप क्षेत्रीय विविधताओं, की परीक्षा के लिए अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, Meas का उपयोग कर हम अलग से देंताते जाइरस (डीजी), हिप्पोकैम्पस है, जो एक trisynaptic सर्किट 27 के माध्यम से जुड़े हुए हैं कोर्नु एम्मोनिस 3 (सीए 3) और कोर्नु एम्मोनिस 1 (सीए 1) लक्षित कर सकते हैं, बाह्य ग्लूटामेट में उप क्षेत्रीय मतभेद की जांच। आरोपण 28 <की वजह से – (4 मिमी लंबाई 1) और नुकसान क्योंकि microdialysis जांच के आकार का/ sup>, 29, उप क्षेत्रीय मतभेद का समाधान करने के लिए मुश्किल हैं। इसके अलावा, ऑप्टिकल प्रणाली केवल इस तरह के एक गलमुच्छा उत्तेजना या प्रकाश झिलमिलाहट, जो उप क्षेत्रीय उत्तेजना 7 अनुमति नहीं देता है के रूप में बाहरी उत्तेजनाओं, के माध्यम से उत्तेजना अनुमति देते हैं। अन्य विधियों का Meas के अंतिम लाभ उनके बाह्य और आंतरिक कनेक्शन भंग किए बिना विवो में इन उपक्षेत्र का अध्ययन करने की क्षमता है।
यहाँ, हम कैसे एक रिकॉर्डिंग प्रणाली (जैसे, FAST16mkIII) संयोजन में Meas के साथ, एक चीनी मिट्टी आधारित एकाधिक microelectrode से मिलकर, भिन्न रिकॉर्डिंग साइटों एजेंटों हस्तक्षेप के लिए अनुमति देने के लिए पर लेपित किया जा सकता का पता चला और analyte संकेत से निकाले जाने का वर्णन करते हैं। हम भी इन सरणियों महानिदेशक, सीए 3 के भीतर इन विवो ग्लूटामेट विनियमन के amperometry आधारित अध्ययन, और anesthetized RTG की सीए 1 हिप्पोकैम्पस उपक्षेत्र के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का प्रदर्शन (TauP301L) 4510 चूहों, एक आमतौर पर इस्तेमाल किया मीटरअल्जाइमर रोग के ouse मॉडल। इसके अलावा, हम रिलुज़ोल साथ चूहों के इलाज से ग्लूटामेट रिहाई और निकासी की तेजी से गतिशीलता के लिए विदेश मंत्रालय प्रणाली की संवेदनशीलता की पुष्टि प्रदान करते हैं एक दवा इन विट्रो में दिखाया गया ग्लूटामेट रिहाई कम होती है और ग्लूटामेट तेज 30, 31, 32, 33 को बढ़ाने के लिए, और TauP301L माउस मॉडल में विवो में इन संबंधित परिवर्तन का प्रदर्शन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विदेश मंत्रालय तकनीक इन विट्रो में और vivo में न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज और तेज की तेजी गतिकी की माप के लिए अनुमति देता है। इसलिए, प्रौद्योगिकी टॉनिक न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर सहित डेटा उत्पादन, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अल्जाइमर एसोसिएशन, (R15AG045812 MNR),, (U54GM104942 MNR), एनआईए (MNR; NIRG-12-242,187), WVU संकाय अनुसंधान सीनेट ग्रांट (MNR), और WVU PSCOR अनुदान इस काम जनरल मेडिकल विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया (MNR)।
Materials
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | 782000 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
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