アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して
Summary
ここでは、トニックおよび酵素結合微小電極アレイ（MEA）を使用して、in vivoで相性の細胞外グルタミン酸変化を測定の空間的及び時間的に正確な方法のセットアップ、ソフトウェアナビゲーション、およびデータ分析を記載しています。
Abstract
神経伝達物質の破壊は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、および不安の根底にある病理学において役割を果たし、多くの場合、中枢神経系（CNS）の疾患の重要な要素です。伝統的に、微小透析は、これらの疾患で発生する神経伝達物質の変化を調べるための最も一般的な（賞賛）技術となっています。微小透析は、組織の広い領域にわたる遅い1-20微細な変化を測定する能力を持っているので、しかし、それは潜在的に脳と低速サンプリング機能内の固有の接続を破壊し、侵襲性の欠点を持っています。比較的新しい技術は、微小電極アレイ（MEA）は、彼らが起こるように、空間的および時間的に正確なアプローチを行う、別個の脳領域内の特定の神経伝達物質の変化を測定するための多くの利点を有しています。また、MEAのを使用して、インビボでの神経伝達物質の変化の測定を可能にする、低侵襲性です。私たちの研究室では、我々ヘクタールアルツハイマー病の病理学に関連する神経伝達物質の変化、グルタミン酸、中に特に興味を持ってきまし。そのため、ここで説明する方法は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、グルタミン酸の潜在的な海馬の中断を評価するために使用されてきました。簡潔には、使用される方法は、対象の神経伝達物質のための非常に選択的な酵素によるマルチサイト微小電極を被覆し、バックグラウンドノイズと干渉を減算する自己参照サイトを使用することを含みます。めっき及び較正後、MEAは、マイクロピペットを用いて構築することができ、定位装置を用いて、関心のある脳領域に低下しました。ここで、この方法は、RTG（TauP301L）4510匹のマウスを麻酔し、正確海馬のサブ領域（DG、CA1およびCA3）を標的とするために、定位装置を使用することを含む説明しました。
Introduction
脳内の神経伝達物質の変化を測定することは、多くの場合、神経伝達物質調節不全によって特徴付けられる中枢神経系（CNS）の疾患を研究する神経科学のための不可欠なツールです。高圧液体クロマトグラフィー（HPLC / EC）と組み合わせた微小透析は、細胞外神経伝達物質レベルの変化1、2、3、4を測定するために最も広く使用される方法であったが、微小透析プローブの空間的及び時間的分解能は神経伝達物質のために理想的ではないかもしれませんこのようなしっかり外空間5,6に調節されるグルタミン酸塩、など。なぜなら遺伝学および画像化における最近の進歩により、 生体内でグルタミン酸をマッピングするために使用することができる追加の方法があります。遺伝的にコードされたグルタミン酸蛍光レポーターを用いて（iGluSnFR）AND二光子イメージング、研究者らは、in vitroおよびde vivo 7、8、9 の両方のニューロン及び星状細胞によってグルタミン酸放出を可視化することができます。注目すべきは、これはより広い視野からの録音を可能にし、脳の固有の接続が中断されることはありません。これらの新しい光学技術は、グルタミン酸動態および感覚誘発反応と神経活動の測定の可視化を可能にするが、それらは個別の脳領域における細胞外空間にグルタミン酸の量を定量化する能力を欠いています。
別の方法は、選択的に自己参照記録方式の使用を介して、例えば、グルタミン酸などの細胞外神経伝達物質レベルを、測定することができる酵素結合微小電極アレイ（MEA）です。 MEA技術は、外傷性脳以下の細胞外グルタミン酸の変化を研究するために使用されてきました損傷10、11、12、13、14、老化 、ストレス15、16、癲癇17、18、アルツハイマー病19、20、及びウイルス模倣21の注入および微小透析に固有の空間的および時間的な制限を超える改善を示します。微小透析は、シナプス22、23の近くに測定する能力を制限し、一方、MEAがシナプス24、25近くの細胞外グルタミン酸スピルオーバーの選択的測定を可能にする高い空間分解能を有しています。第二に、マイクロダイアリシスの低い時間分解能（1 – 20分）を調査する能力を制限します第二の範囲26にミリ秒で発生したグルタミン酸放出およびクリアランスの速いダイナミクス。グルタミン酸のリリースやクリアランスの違いは強壮剤の対策では明らかではないかもしれないので、グルタミン酸レベルを休んで、グルタミン酸放出およびクリアランスを直接測定することが不可欠かもしれません。 MEAは、その高い時間分解能（2ヘルツ）及び検出の下限（<1μM）にこのような対策を可能にします。第三に、MEAのは、ラットまたはマウスの海馬のような特定の脳領域内の神経伝達物質で小地域変動の検査を可能にします。例えば、細胞外グルタミン酸で小地域の違いを調べるために、我々は別々に歯状回（DG）、trisynaptic回路27を介して接続され、海馬のアンモン角3（CA3）およびアンモン角1（CA1）を標的とすることができるのMEAを使用。移植28 <によって引き起こさ- （4mmの長さ1）及び損傷ため微小透析プローブのサイズの/ SUP>、29、小地域の違いが対処するのは困難です。また、光学系は、小地域刺激7を許可しないようなウィスカ刺激または光のちらつきなどの外部刺激を介して刺激を可能にします。他の方法に比べてのMEAの最終利益は、彼らの外因性および内因性の接続を中断することなく、生体内でこれらの小領域を研究する能力です。
ここでは、セラミックベースのマルチサイト微小電極からなる膜電極アッセンブリと組み合わせて、どのように記録システム（ 例えば 、FAST16mkIII）記述、示差検体信号から検出して除去する干渉物質を可能にするために、記録部位に塗布することができます。我々は、これらのアレイは、麻酔RTG（TauP301L）4510匹のマウスのDG、CA3およびCA1海馬の小領域内のin vivoグルタミン酸調節、一般的に使用されるM個の電流測定に基づく研究のために使用することができ、また性を実証しますアルツハイマー病のウーズモデル。また、我々はリルゾールでマウスを処理することによりグルタミン酸放出およびクリアランスの速いダイナミクスへのMEAシステムの感度の確認を提供し、in vitroで示された薬物は、グルタミン酸放出を減少させ、グルタミン酸の取り込み30、31、32、33を高めるために、そして、TauP301Lマウスモデルにおけるin vivoでのこれらのそれぞれの変化を実証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
MEA技術は、in vitroおよびde vivoでの神経伝達物質の放出と吸収の速い反応速度を測定することができます。したがって、この技術は強壮、神経伝達物質のレベルを含むデータ出力、誘発神経伝達物質の放出、および神経伝達物質のクリアランスのさまざまなを生成します。 MEAの使用は、比較的複雑な手順であるため、しかし、成功した使用に最適化される必?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
（; U54GM104942 MNR）、NIA（MNR; R15AG045812）、アルツハイマー病協会（MNR; NIRG-12から242187）、WVU学部研究上院グラント（MNR）、およびWVU PSCORグラントこの作品は、国立総合医科学研究所によってサポートされていました（MNR）。
Materials
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | 782000 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
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