Het creëren van cardiale weefsels die mechanische integratie van sferoïden tonen met behulp van 3D bioprinting
Summary
Dit protocol beschrijft 3D bioprinting van hartweefsel zonder het gebruik van biomaterialen. 3D bioprinted cardiac patches vertonen mechanische integratie van component sferoïden en zijn zeer veelbelovend in hartweefselregeneratie en als 3D-modellen van hart-en vaatziekten.
Abstract
Dit protocol beschrijft 3D bioprinting van hartweefsel zonder gebruik van biomaterialen, waarbij alleen cellen worden gebruikt. Cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten worden eerst geïsoleerd, geteld en gemengd bij gewenste celverhoudingen. Ze worden gecultiveerd in individuele putten in ultra-low attachment 96-wells platen. Binnen 3 dagen slaat er spheroidsvorm. Deze sferoïden worden dan opgevangen door een mondstuk met vacuümzuigkracht en gemonteerd op een naald array met behulp van een 3D bioprinter. De sferoïden mogen dan op de naald array zitten. Drie dagen na 3D bioprinting worden de sferoïden verwijderd als een intacte patch, die al spontaan slaat. 3D bioprinted cardiac patches vertonen mechanische integratie van component sferoïden en zijn zeer veelbelovend in hartweefselregeneratie en als 3D-modellen van hart-en vaatziekten.
Introduction
Er zijn veel verschillende methoden van 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting wordt vaak geclassificeerd door printtechnologie 1 , met voorbeelden zoals inkjet bioprinting, microextrusion bioprinting, laser assisted bioprinting, een combinatie van methoden of nieuwere benaderingen. 3D bioprinting kan ook worden ingedeeld in steigervrije of steigerafhankelijke methoden 4 . De meeste methoden van 3D bioprinting zijn steigerafhankelijk, waar biomaterialen nodig zijn, bijv. Bioinks 5 of steigers 6 . Echter, steigerafhankelijke 3D bioprinting ondervindt veel problemen en beperkingen 4 , 7 , zoals immunogeniciteit van steigermateriaal, kosten van eigen bio-verbindingen, trage snelheid en toxiciteit van afbraakproducten.
SCAFVouwvrije hartweefseltechniek met behulp van sferoïden is geprobeerd 8 , met het potentieel om deze nadelen van steigerafhankelijke weefseltechniek te overwinnen. Zoals echter door de auteurs in dat papier werd erkend, was het moeilijk om robuuste handgreep en positionering van spheroïden op vaste locaties, in het proces van biofabricatie. Het gelijktijdige gebruik van 3D bioprinting en spiraal gebaseerde weefseltechniek heeft de mogelijkheid om deze moeilijkheden te overwinnen. In dit protocol beschrijven we 3D bioprinting van hartweefsels zonder andere biomaterialen, waarbij alleen cellen in de vorm van sferoïden worden gebruikt.
Steigervrije spheroïde-gebaseerde 3D bioprinters 9 hebben de mogelijkheid om individuele spheroïden op te halen met behulp van vacuümzuigen en positioneren op een naald array. Het concept van positionering sferoïden op een naald array in 3D bioprinting, is geïnspireerd op het gebruik van naald arrays (bekend als " kenzan ") in de oude JapaNese kunst van bloemstuk, ikebana. Met dit systeem kunnen spheroïden precies in elke configuratie gepositioneerd worden, waardoor de individuele spheroïden over een korte periode samenvoegen om een 3D bioprintend weefsel te creëren. Met deze methode kunnen spheroïden gemakkelijk worden gemanipuleerd, met mogelijke implicaties voor de toekomst van de stellingvrije organische biofabricatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.
One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen: Magic That Matters Fund voor Cardiovascular Research en het Maryland Stamcellen Research Fund (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D’Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O’Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. . Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. . Endothelial Cell Systems – Technical Information & Instructions.,. , (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. . Immunofluorescence Method for IHC Detection. , (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
