Création d'un tissu cardiaque exposant l'intégration mécanique des sphéroïdes à l'aide de la bioprinterie 3D

Résumé

Ce protocole décrit la bioprinture 3D du tissu cardiaque sans l'utilisation de biomatériaux. Les plaques cardiovasculaires bioprinées 3D présentent une intégration mécanique des sphéroïdes constitutifs et sont très prometteuses dans la régénération des tissus cardiaques et comme modèles 3D de maladies cardiaques.

Résumé

Ce protocole décrit la bioprinture 3D du tissu cardiaque sans l'utilisation de biomatériaux, en utilisant uniquement des cellules. Les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes sont d'abord isolés, comptés et mélangés aux rapports cellulaires désirés. Ils sont co-cultivés dans des puits individuels dans des plaques à 96 puits ultra-bas. Dans les 3 jours, les sphéroïdes battent. Ces sphéroïdes sont ensuite ramassés par une buse à l'aspiration sous vide et assemblés sur une matrice d'aiguille à l'aide d'une bioprintrice en 3D. Les sphéroïdes sont alors autorisés à fusionner sur le réseau d'aiguilles. Trois jours après la bioprammation en 3D, les sphéroïdes sont enlevés comme un patch intact, qui bat déjà spontanément. Les plaques cardiovasculaires bioprinées 3D présentent une intégration mécanique des sphéroïdes constitutifs et sont très prometteuses dans la régénération des tissus cardiaques et comme modèles 3D de maladies cardiaques.

Introduction

Il existe de nombreuses méthodes différentes de bioprinture 3D ^{1 , 2 , 3} . La bioprinture 3D est fréquemment classée par la technologie d'impression ¹ , avec des exemples tels que la bioprin à jet d'encre, la bioprin de microextrusion, la biopramétrie assistée par laser, une combinaison de méthodes ou des approches plus récentes. La bioprinture en 3D peut également être classée dans des méthodes sans échafaudage ou dépendantes de l'échafaudage ⁴ . La plupart des méthodes de biopramétrie en 3D dépendent de l'écha....

Protocole

1. Préparation des cardiomyocytes

1. Générer et cultiver des cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) sur des plaques à 6 puits revêtues d'une matrice de membrane basale telle que décrite ¹⁰ .
2. Différenciez les hiPSC dans les cardiomyocytes dérivés de HiPSC (HiPSC-CM) en utilisant les méthodes décrites précédemment ^{11 , 12} .
3. Le jour 19 après différenciation, isoler les cardiomyocytes en utilisant 2 ml de Trypsin / EDTA 0,05% dans chaque puits pendant 5 minutes à température ambiante.
4. Surveiller les cardiomyocytes sous un m....

Résultats

À la fin de l'étape 4.4 (co-culture), les cellules de chaque puits devraient agréger au bas des plaques en U-fond de 96 puits ultra-bas pour former des sphéroïdes par gravité. Ces sphéroïdes contiennent du hiPSC-CM, des HCF et des HUVEC, et peuvent être inspectés visuellement sous microscope optique, où ils devraient apparaître circulaires par projection bidimensionnelle ( figure 1 ). À la fin de l'étape 6.3, le patch cardiaque bioprinté en 3D devrai.......

Discussion

Il est important d’utiliser des sphéroïdes fonctionnels pour la bio-impression 3D. Si les sphéroïdes ne battent pas, continuer à les utiliser entraînera invariablement un patch bio-imprimé en 3D non fonctionnel.

L’un des avantages de cette approche est la possibilité de manipuler le contenu cellulaire du patch en faisant varier le nombre total de cellules et le pourcentage de cardiomyocytes, de cellules endothéliales et de fibroblastes dans les sphéroïdes. Cela permet d’imprimer de nombreux ty.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Geltrex	Invitrogen  ;
Trypsine/EDTA 0,05 %	Thermo Fisher	15400054
Defined Inhibiteur de la trypsine 0,0125 %	Thermo Fisher	R007100
RPMI Cell	Media Invitrogen	11875-093	RPMI complété par B27 constitue un milieu de culture HIPSC-CM
Supplément B-27 Thermo	Fisher	17504044	RPMI complété par B27 constitue HIPSC-CM milieux de culture
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Fibroblastes cardiaques humains (type ventriculaire adulte)	Sciencell	6310
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine	Lonza	CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates  ;	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio Imprimante 3D	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0,4 %	Thermo Fisher	15250061
Troponine T Anticorps	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Anticorps	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant avec DAPI	Thermo Fisher	P36935

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