Oprettelse af hjertevæv, der udviser mekanisk integration af sfæroider ved hjælp af 3D bioprinting
Summary
Denne protokol beskriver 3D bioprinting af hjertevæv uden brug af biomaterialer. 3D bioprintede hjertepletter udviser mekanisk integration af komponent sfæroider og er meget lovende i hjertevævregenerering og som 3D-modeller af hjertesygdomme.
Abstract
Denne protokol beskriver 3D bioprinting af hjertevæv uden brug af biomaterialer ved anvendelse af kun celler. Kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster isoleres først, tælles og blandes ved ønskede celleforhold. De er samdyrket i individuelle brønde i 96-brønds plader med ultra-low attachment. Inden for 3 dage, formende sfæroider form. Disse sfæroider hentes derefter af en dyse ved hjælp af vakuumsugning og monteres på en nålopsætning ved hjælp af en 3D bioprinter. Sfærerne får lov til at smelte på nålen. Tre dage efter 3D bioprinting fjernes sfæroiderne som en intakt patch, som allerede spontant slår. 3D bioprintede hjertepletter udviser mekanisk integration af komponent sfæroider og er meget lovende i hjertevævregenerering og som 3D-modeller af hjertesygdomme.
Introduction
Der findes mange forskellige metoder til 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting klassificeres hyppigt af trykteknologi 1 , med eksempler som inkjet bioprinting, microextrusion bioprinting, laserassisteret bioprinting, en kombination af metoder eller nyere tilgange. 3D bioprinting kan også klassificeres i stilladsfrie eller stilladsafhængige metoder 4 . De fleste metoder til 3D bioprinting er stilladsafhængige, hvor der er behov for biomaterialer, fx bioinks 5 eller stilladser 6 . Stilladsafhængig 3D bioprinting står over for mange problemer og begrænsninger 4 , 7 , som f.eks. Immunogenicitet af stilladsmateriale, omkostninger til proprietære biobrændstoffer, langsom hastighed og toksicitet af nedbrydningsprodukter.
SCAFFoldfri hjertevævsteknik ved anvendelse af sfæroider er blevet forsøgt 8 , med potentialet til at overvinde disse ulemper ved stilladsafhængig vævsteknik. Som det blev erkendt af forfatterne i det pågældende papir, havde det imidlertid været vanskeligt at håndtere og positionere sfæroider på faste steder under biofabricering. Den samtidige brug af 3D bioprinting og sfæroidbaseret vævsteknik har potentialet til at overvinde disse vanskeligheder. I denne protokol beskriver vi 3D bioprinting af hjertevæv uden andre biomaterialer ved kun at bruge celler i form af sfæroider.
Stilladsfri sfæroid-baserede 3D-bioprintere 9 har evnen til at samle individuelle sfæroider ved hjælp af vakuumsugning og placere dem på en nålarray. Konceptet med positionering af sfæroider på en nålestik i 3D bioprinting er inspireret af brugen af nålarrayer (kendt som " kenzan ") i den gamle JapaNese kunst af blomster arrangement, ikebana. Dette system gør det muligt at placere spheroider præcist i enhver konfiguration og resulterer i, at de individuelle sfæroider smelter sammen i løbet af en kort periode for at skabe et 3D bioprintet væv. Denne metode gør det således muligt for spheroider at blive manipuleret med lethed, med potentielle konsekvenser for fremtiden for stilladsfri organbiobroduktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.
One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender følgende finansieringskilder: Magic That Matters Fund for Kardiovaskulær Forskning og Maryland Stem Cell Research Fund (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D’Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O’Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. . Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. . Endothelial Cell Systems – Technical Information & Instructions.,. , (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. . Immunofluorescence Method for IHC Detection. , (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
