चूहा स्नायु पार वर्गों मायोसिन भारी चेन immunohistochemistry का उपयोग में स्नायु फाइबर जनसंख्या विश्लेषण के लिए एक तेजी से स्वचालित प्रोटोकॉल
Summary
यहाँ, हम तेजी से पेशी फाइबर का विश्लेषण करती है, जो बेहतर धुंधला गुणवत्ता, और इस तरह स्वत: अधिग्रहण और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग फाइबर आबादी की मात्रा की अनुमति देता है के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
पेशी फाइबर आबादी की मात्रा रोग, मानसिक आघात, और कंकाल की मांसपेशी संरचना पर विभिन्न अन्य प्रभावों के प्रभाव की गहन जानकारी प्रदान करता है। विभिन्न समय लेने वाली तरीकों पारंपरिक रूप से अनुसंधान के कई क्षेत्रों में फाइबर आबादी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, हाल ही मायोसिन भारी श्रृंखला प्रोटीन अभिव्यक्ति के आधार पर प्रतिरक्षाऊतकरसायन तरीकों का विकास एक ही चयन में कई फाइबर प्रकारों की पहचान करने के लिए एक त्वरित विकल्प प्रदान करते हैं। यहाँ, हम धुंधला की गुणवत्ता में सुधार के लिए एक, तेजी से विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, पूरे पार वर्गों और ImageJ के साथ फाइबर आबादी का स्वत: मात्रा का स्वत: अधिग्रहण की इजाजत दी। इस प्रयोजन के लिए, एम्बेडेड कंकाल की मांसपेशियों, पार वर्गों में कटौती कर रहे हैं माध्यमिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी और DAPI सेल नाभिक धुंधला के लिए साथ मायोसिन भारी जंजीरों एंटीबॉडी का उपयोग कर दाग। पूरे पार वर्गों तो उच्च संकल्प समग्र प्राप्त करने के लिए एक स्लाइड स्कैनर का उपयोग कर स्वचालित रूप से जांच की जाती हैपूरे नमूना की तस्वीरें। फाइबर आबादी विश्लेषण बाद में ImageJ के लिए एक स्वचालित मैक्रो का उपयोग, धीमी गति से मध्यवर्ती और तेजी से फाइबर अंदाजा लगाना प्रदर्शन कर रहे हैं। हम पहले से पता चला है कि इस विधि ± 4% की एक डिग्री करने के लिए मज़बूती से फाइबर आबादी की पहचान कर सकते हैं। इसके अलावा, इस विधि अंतर उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता और समय के अनुसार काफी खुला स्रोत मंच ImageJ का उपयोग कर विश्लेषण कम कर देता है।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी संरचना इस तरह उम्र बढ़ने 1, 2, व्यायाम 3, 4, 5, 6, 7, या इस तरह के रोग 8, 9, 10 या मानसिक आघात के रूप में 11 pathophysiological प्रक्रियाओं के रूप में शारीरिक प्रक्रियाओं के दौरान व्यापक परिवर्तन से गुजरता है। इसलिए, इन प्रक्रियाओं के संरचनात्मक प्रभाव पर शोध ध्यान के कई क्षेत्रों कार्यात्मक परिवर्तनों को समझने के लिए। मांसपेशी समारोह का निर्धारण महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक मांसपेशी फाइबर की संरचना है। मांसपेशी फाइबर अलग मायोसिन भारी श्रृंखला (MHC) प्रोटीन व्यक्त करने और इस तरह, धीमी गति से मध्यवर्ती, या तेजी से फाइबर 7, 12, 13 में वर्गीकृत किया जाता </sup >, 14, 15, 16, 17। Physiologically, मांसपेशियों शरीर में उनके कार्य के आधार पर अलग मांसपेशी फाइबर रचनाओं की है। पेशी फाइबर टाइपिंग का उपयोग करना, फाइबर आबादी, 17 शारीरिक या pathophysiological प्रक्रियाओं से 7 रूपांतरण की पहचान के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। ऐतिहासिक रूप से, समय लेने वाली अनेक विधियों का मांसपेशी फाइबर प्रकार के बीच अंतर करने के लिए लागू किया गया है। इस प्रयोजन के लिए मांसपेशी फाइबर या तो विभिन्न पीएच स्तर या मांसपेशियों एंजाइम गतिविधि पर मायोसिन ATPase के सक्रियण की प्रतिक्रिया के आधार पर वर्गीकृत किया गया। विभिन्न फाइबर गुणों एक ही चयन में मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है के रूप में, कई पार वर्गों सभी मांसपेशी फाइबर की पहचान करने और मैनुअल मात्रा 14, 16, 17 के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक थे,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22। इसके विपरीत, हाल के प्रकाशनों मायोसिन भारी श्रृंखला प्रोटीन के खिलाफ इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री (आईएचसी) का इस्तेमाल किया तेजी से कई फाइबर प्रकार दाग के लिए एक एकल पार वर्गों में। इस प्रक्रिया के लाभ के आधार पर यह अब पेशी फाइबर आबादी विश्लेषण 19, 23, 24 में स्वर्ण मानक माना जाता है। सुधार आईएचसी धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम हाल ही में पता चलता है कि पूरे मांसपेशी पार वर्गों और बाद स्वत: पेशी फाइबर मात्रा की पूरी तरह से स्वचालित अधिग्रहण खुला स्रोत मंच ImageJ का उपयोग संभव है में सक्षम थे। मैनुअल मात्रा की तुलना में, हमारे प्रक्रिया 4% ± जबकि सटीक होने के प्रति स्लाइड के लिए आवश्यक समय (मैनुअल का लगभग 10% का विश्लेषण करती है) में एक महत्वपूर्ण कमी प्रदान की 25 </s> ऊपर।
इस विधि के समग्र लक्ष्य एक खुला स्रोत मंच का उपयोग कर एक तेजी से, विश्वसनीय, उपयोगकर्ता के स्वतंत्र स्वत: पेशी फाइबर मात्रा करने के लिए पूरे चूहे की मांसपेशियों में गाइड का वर्णन करने के लिए है। इसके अलावा, हम संभावित संशोधनों कि इस तरह के चूहों या मानव मांसपेशियों के रूप में अन्य नमूनों के लिए इसके उपयोग की अनुमति होगी का वर्णन।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम अध्ययन करने और स्वचालित रूप से एक समय कुशल तरीके से इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के माध्यम से चूहा पार वर्गों की पेशी फाइबर आबादी आकलन करना बहुत व्यापक रूप से सुलभ कार्यप्रणाली का प्रदर्शन। reprodu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन क्रिश्चियन डोप्पलर रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया। हम परियोजना के दौरान समर्थन के लिए वियना, आस्ट्रिया के चिकित्सा विश्वविद्यालय में कोर सुविधा इमेजिंग से सबाइन रॉशचर धन्यवाद देना चाहते हैं। प्राथमिक एंटीबॉडी, Schiaffino, एस द्वारा विकसित किए गए विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त किया, एनआईएच की NICHD द्वारा बनाई गई और आयोवा, जीवविज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आयोवा विश्वविद्यालय में बनाए रखा।
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
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