ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル
Summary
ここで、我々は、改善された染色質、及びそれによって自動取得し、自由に利用可能なソフトウェアのImageJを用いた繊維集団の定量化を可能にする迅速な筋線維分析、のためのプロトコルを提示します。
Abstract
筋線維集団の定量化は、疾患、外傷、および骨格筋組成上の様々な他の影響の影響をより深く洞察を提供します。様々な時間のかかる方法は、伝統的な研究の多くの分野で、繊維集団を研究するために使用されています。しかし、最近、単一のセクションに複数の繊維の種類を識別するために迅速な代替手段を提供ミオシン重鎖タンパク質の発現に基づいて免疫組織化学的方法を開発しました。ここでは、全体の断面の自動取得とImageJの有する繊維集団の自動定量化を可能にする、改良された染色質のため、迅速な信頼性及び再現性のプロトコルを提示します。この目的のために、埋め込まれた骨格筋は、細胞核染色のための二次蛍光抗体およびDAPIでミオシン重鎖抗体を用いて染色し、断面にカットされています。全体の断面は、高解像度の複合体を得るためにスライドスキャナを使用して自動的に走査されます試料全体の絵。ファイバー人口分析は、その後、ImageJのための自動化されたマクロを使用して、遅い中間と高速繊維を定量化するために実施されています。我々は以前、この方法は、±4％の程度まで確実繊維集団を識別することができることを示しています。加えて、この方法は、ユーザ間のばらつきを低減し、大幅にオープンソースプラットフォームのImageJを用いて分析時間当り。
Introduction
骨格筋組成物は、加齢1、2、運動3、4、5、6、7、またはそのような疾患8、9、10または外傷11などの病態生理学的プロセスのような生理学的プロセス中深い変化を受けます。したがって、研究のいくつかのフィールドは、機能的な変化を理解するために、これらのプロセスの構造的な影響に集中します。筋肉の機能を決定する重要な側面の一つは、筋線維の組成物です。筋線維は、異なるミオシン重鎖（MHC）タンパク質を発現し、それにより、 図13に示すように 、低速、中間、又は高速繊維7、12に分類され</sup >、14、15、16、17。生理学的に、筋肉は体にその機能に応じて、異なる筋線維組成を有します。筋線維タイプを使用して、繊維集団は、生理的または病態生理学的過程7,17に適応を同定するために定量化することができます。歴史的に、時間のかかる方法の数は、筋線維の種類を区別するために適用されています。この目的のために、筋線維は、種々のpHレベルまたは筋肉酵素活性におけるミオシンATPアーゼの反応のいずれかにより分類しました。異なる繊維品質が単一のセクションで評価することができなかったように、複数の断面は、全ての筋線維を識別し、手動定量14、16、17を可能にするために必要でした= "XREF"> 18、19、20、21、22。対照的に、最近の刊行物は、急速に、単一の断面における複数の繊維タイプを染色するためにミオシン重鎖タンパク質に対する免疫組織化学（IHC）を用いました。この手順の利点に基づいて、それは今筋線維人口分析19、23、24におけるゴールドスタンダードと考えられています。改善IHC染色プロトコルを使用して、我々は最近、全体の筋肉の断面の完全自動取得とその後の自動筋繊維の定量化は、オープンソースプラットフォームのImageJを使用して実現可能であることを示すことができました。手動定量に比べ、我々の手順を4〜25％、±正確ながらスライドごとに必要な時間の有意な減少（手動分析の約10％）を得ました</s>アップ。
この方法の全体的な目標は、オープンソースのプラットフォームを使用して、全ラットの筋肉中に自動筋繊維定量化への迅速な、信頼性の高い、ユーザーから独立したガイドを記述することです。また、我々は、マウスまたはヒトの筋肉などの他の検体のためのその使用を可能にする可能性のある変更について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、勉強と自動的に時間効率的な方法で免疫組織化学を経由して、ラットの断面の筋線維集団を定量化するために広くアクセス方法論を示しています。再現性のために、我々は、ステップの説明及び本研究に記載されていない他の種における用途のための潜在的な変更による詳細なステップを示します。さらに、我々は、最適な機能とその限界のための前提条件を手順の利点を議?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、クリスチャン・ドップラー研究財団によってサポートされていました。私たちは、プロジェクト全体のサポートのためにオーストリアのウィーン医科大学のコア施設イメージングからサビーン・ラウシャー感謝したいと思います。一次抗体は、NIHのNICHDによって作成され、アイオワ、生物学科、アイオワ州アイオワシティの大学で維持、発達研究ハイブリドーマバンクから入手した、Schiaffino、S.によって開発されました。
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
