En Rapid Automatiserad Protokoll för Muscle Fiber Population Analysis i råttmuskel Cross sektioner med hjälp tunga kedjan från myosin Immunohistokemi
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för snabb muskelfiberanalyser, vilket möjliggör förbättrad färgningskvalitet, och därmed automatisk förvärv och kvantifiering av fiber populationer med hjälp av fritt tillgänglig programvara ImageJ.
Abstract
Kvantifiering av muskelfiber populationer ger en djupare insikt i effekterna av sjukdom, trauma, och olika andra influenser på skelettmuskelsammansättning. Olika tidskrävande metoder har traditionellt använts för att studera fiber populationer i många forskningsområden. Emellertid nyligen utvecklat immunohistokemiska metoder baserade på tunga kedjan från myosin proteinuttryck tillhandahålla ett snabbt alternativ för att identifiera multipla fibertyper i en enda sektion. Här presenterar vi ett snabbt, tillförlitligt och reproducerbart protokoll för förbättrad färgningskvalitet, vilket möjliggör automatisk inhämtning av hela tvärsnitt och automatisk kvantifiering av fiber populationer med ImageJ. För detta ändamål, är inbäddade skelettmuskler skurna i tvärsektioner, färgades med användning av myosin tunga kedjor antikroppar med sekundära fluorescerande antikroppar och DAPI för cellkärnor färgning. Hela tvärsnitt sedan scannas automatiskt med hjälp av en bild scanner för att erhålla hög upplösning sammansattbilder av hela provet. Fiberpopulationsanalyser därefter utföras för att kvantifiera långsamma, mellan- och snabba fibrer med användning av en automatiserad makro för ImageJ. Vi har tidigare visat att denna metod kan identifiera fiberpopulationer tillförlitligt till en grad av ± 4%. Dessutom reducerar denna metod interanvändar variabilitet och tid per analyser signifikant med hjälp av öppen källkod plattform ImageJ.
Introduction
Skelettmuskelkompositionen undergår stora förändringar under fysiologiska processer såsom åldrande 1, 2, motion 3, 4, 5, 6, 7, eller patofysiologiska processer såsom sjukdom 8, 9, 10 eller trauma 11. Därför flera forskningsområden koncentrera sig på de strukturella effekterna av dessa processer förstå funktionella förändringar. En av de viktigaste aspekterna som bestämmer muskelfunktion är sammansättningen av muskelfibrer. Muskelfibrer uttrycka olika myosin tung kedja (MHC) -proteiner och därmed klassificeras i långsamma, mellanliggande, eller snabba fibrerna 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Fysiologiskt, muskler har olika muskelfiberkompositioner beroende på deras funktion i kroppen. Med användning av muskelfibermaskinskrivning, kan fiberpopulationer kvantifieras för att identifiera anpassning till fysiologiska eller patofysiologiska processer 7, 17. Historiskt har ett antal tidskrävande metoder använts för att skilja mellan muskelfibertyper. För detta ändamål, var muskelfibrer klassificeras antingen genom reaktivitet av myosin ATPas vid olika pH-nivåer eller muskelenzymaktivitet. Som olika fiberkvaliteter inte kunnat utvärderas i en enda sektion, har flera tvärsektioner som krävs för att identifiera alla muskelfibrer och medge manuell kvantifiering 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. I kontrast, färska publikationer används immunohistokemi (IHC) mot tunga kedjan från myosin protein till snabbt färga flera fibertyper i en enda tvärsektioner. Baserat på fördelarna med detta förfarande är det nu anses vara den gyllene standarden i muskelfibrer populationsanalys 19, 23, 24. Med användning av förbättrade IHC färgningsprotokollen var vi nyligen kunnat visa att det helautomatiska förvärvet av hela muskel tvärsnitt och efterföljande automatisk muskelfiber kvantifiering är möjlig med användning av öppen källkod plattform ImageJ. Jämfört med manuell kvantifiering, vårt förfarande gav en signifikant minskning av tiden (ungefär 10% av manuell analyser) som krävs per bild samtidigt som den är en noggrannhet på ± 4% 25 </supp>.
Det övergripande målet med denna metod är att beskriva en snabb, tillförlitlig, användaroberoende guide till automatisk muskelfiber kvantifiering i hel råttmuskler med användning av en öppen källkod plattform. Dessutom beskriver vi potentiella modifieringar som skulle tillåta dess användning för andra prover såsom möss eller humana muskler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här visar vi en allmänt tillgänglig metod för att studera och automatiskt kvantifiera muskelfiber populationer av råtta tvärsnitt genom immunhistokemi på ett tidseffektivt sätt. För reproducerbarhet, presenterar vi en detaljerad steg för steg beskrivning och potentiella modifieringar för applikationer i andra arter som inte beskrivs i denna studie. Vidare diskuterar vi fördelarna med förfarandet, förutsättningar för optimal funktion och dess begränsningar.
Närvarande,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Christian Doppler Research Foundation. Vi vill tacka Sabine Rauscher från Core Facility Imaging vid medicinska universitetet i Wien, Österrike stöd under hela projektet. Primära antikroppar har utvecklats av Schiaffino, S., som erhållits från utvecklingsstudier Hybridoma Bank, skapad av NICHD av NIH och hölls vid University of Iowa, Institutionen för biologi, Iowa City, IA.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
